三重共鳴核磁気共鳴分光法

三重共鳴実験は、 3種類の原子核（最も一般的には ¹ H、¹⁵ N、¹³ C）をリンクする多次元核磁気共鳴分光法（NMR）実験のセットです。これらの実験は、同位体濃縮タンパク質内の特定の原子に特定の共鳴信号を割り当てるためによく使用されます。この技術は、1990年にAd Bax、Mitsuhiko Ikura、Lewis Kayによる論文で初めて説明され、 ^{[1] [2]}、その後、さらなる実験が一連の実験に追加されました。これらの実験の多くは、それ以来、NMRによるタンパク質構造の決定においてNMR共鳴の連続割り当てに使用される標準的な実験セットになっています。これらは現在、タンパク質の溶液NMR研究の不可欠な部分であり、固体NMRでも使用できます。^{[3] [4]}

原子レベルでタンパク質の構造を決定する主な方法が2つあります。1つ目はX線結晶構造解析で、1958年にミオグロビンの結晶構造が決定されたときに始まりました。2つ目の方法はNMRで、1980年代にクルト・ヴュートリッヒがタンパク質のNMR構造決定の枠組みを概説し、小さな球状タンパク質の構造を解明したときに始まりました。^[5] NMRによるタンパク質の構造決定の初期の方法は、プロトンベースの同核NMR分光法に依存していましたが、これだと決定できるタンパク質のサイズが約10 KDaに制限されていました。この制限は、タンパク質内の多数の核からNMR信号を割り当てる必要があるためです。大きなタンパク質では、核の数が多いほど共鳴が混雑し、タンパク質のサイズが大きくなると信号が広がるため、共鳴の割り当てが難しくなります。これらの問題は、 ¹⁵ Nと¹³ Cの化学シフトに関して陽子スペクトルを編集できる異核NMR分光法を使用することで軽減される可能性があり、スペクトルの次元数を増やすことで共鳴の重なりを減らすこともできます。1990年に、Ad Baxと同僚は三重共鳴技術を開発し、¹⁵ Nと¹³ Cで同位体標識されたタンパク質の実験を行いました^[1] 。その結果、スペクトルは劇的に簡素化され、共鳴の割り当てプロセスが大幅に容易になり、NMRで決定できるタンパク質のサイズが増加しました。

これらの三重共鳴実験では、特定の核ペア間の比較的大きな磁気結合を利用してそれらの接続を確立します。具体的には、 ¹ J _NH、¹ J _CH、¹ J _CC、および¹ J _{CN結合を使用して、核間のスカラー接続経路を確立します。磁化移動プロセスは、より小さく可変的な}³ J _HH結合を介した単一のステップではなく、複数の効率的な 1 結合磁化移動ステップを介して行われます。1結合結合のサイズが比較的大きく均一性が高いため、特定のタンパク質全体で実質的に均一で、コンフォメーションにほとんど依存しない効率的な磁化移動スキームを設計できます。^{[3] 31} P を含む三重共鳴実験は、核酸研究にも使用できます。^[6]

これらの実験は、通常、実験に関係する核 (H、N、および C) によって名前が付けられます。CO はカルボニル炭素を指し、CA と CB はそれぞれCα と Cβを指し、同様に HA と HB は Hα と Hβ を指します (実験の例については図を参照)。名前の核は磁化移動の経路と同じ順序で並べられており、括弧内の核は磁化移動経路に関係していますが記録されません。感度の理由から、これらの実験は通常、INEPTおよび逆 INEPT ステップを介して、陽子で開始して陽子で終了します。したがって、これらの実験の多くは、名前に示されてはいませんが、信号を取得するために磁化が開始陽子に戻される「アウトアンドバック」実験と呼ばれるものです。

いくつかの実験は、タンパク質の共鳴割り当てのために並行して使用されます。たとえば、HNCACB は CBCA(CO)NH と 1 組の実験として一緒に使用されることがあります。これらの実験のすべてを連続割り当てのために記録する必要はありません (2 つでも実行できます)。ただし、追加の実験のペアは割り当ての正確さを独立して評価するのに役立ち、割り当てに曖昧さがある場合は情報の冗長性が必要になることがあります。側鎖共鳴を完全に割り当てるには、他の実験も必要です。

これらの実験の多くには感度向上のためのTROSYバージョンが存在する。 ^{[7]三重共鳴実験は}固体NMRにおけるマジック角回転NMRスペクトルの配列特異的バックボーン共鳴割り当てにも使用できる。^{[4] [8]}

多数の三重共鳴 NMR 実験が作成されており、以下にリストされている実験は網羅的なものではありません。

この実験は、残基のアミドと、先行する残基のカルボニル炭素との結合性を示します。^[2] これは三重共鳴実験の中で最も感度が高いものです。アスパラギンとグルタミンの側鎖カルボキサミドもこの実験で確認できます。さらに、カルボキサミド基と同様の結合定数を持つアルギニンのグアニジノ基もこのスペクトルに現れることがあります。この実験は、HN(CA)COと一緒に使用されることもあります。

ここで、残基のアミド共鳴は、同じ残基のカルボニル炭素だけでなく、前の残基のカルボニル炭素とも相関している。残基内共鳴は通常、残基間共鳴よりも強い。^[9]

この実験は、残基のアミドの共鳴を、その前の残基のCαと相関させる。この実験は、HNCAと一緒に使用されることが多い。^[10]

この実験は、残基のアミドの化学シフトを、同じ残基のCαと、その前の残基のCαと相関させます。^[2]各ストリップには、残基間Cαピークと残基内Cαピークの2つのピークがあります。前のCαからのピークは、残基間Cαのみを示すHN(CO)CA実験から識別できます。

CBCA(CO)NH、またはHN(CO)CACBは、残基のアミドの共鳴を、前の残基のCαおよびCβと相関させます。^[11] そのため、各残基について、CαとCβに対応する2つのピークが見られます。この実験は通常、HNCACBと一緒に使用されます。この実験では、グルタミンとアスパラギンの側鎖カルボキサミドもこのスペクトルに現れます。CBCA(CO)NHは、脂肪族プロトンで始まり、アミドプロトンで終わるため、より正確には(HBHA)CBCA(CO)NHと呼ばれることもあり、そのため、HN(CO)CACBのような往復実験ではありません。

HNCACB、またはCBCANHは、残基のアミドの化学シフトを、同じ残基のCαとCβ、およびその前の残基のCαとCβと相関させます。^[12] 各ストリップでは、4つのピークが見える場合があります。2つは同じ残基から、2つは前の残基からものです。前の残基からのピークは通常弱く、CBCA(CO)NHを使用して識別できます。この実験では、CαとCβのピークは逆位相です。つまり、Cαが正のピークとして表示されれば、Cβは負になり、CαとCβの識別が簡単になります。CBCA(CO)NH / HNCACBの一連の実験からのCβの追加情報により、HN(CO)CA / HNCAよりも残基の種類の識別が容易になりますが、HNCACBは感度の低い実験であり、一部のタンパク質には適さない場合があります。

CBCANH 実験は、HNCACB よりも線幅の問題の影響を受けやすいため、より大きなタンパク質にはあまり適していません。

この実験は、同じ残基内のカルボニル炭素とHα原子によるCαとCβの間の結合性を示しています。^[13]アスパラギン酸とグルタミン酸の 側鎖カルボキシル基は、このスペクトルに弱く現れることがあります。

この実験は残基のアミドと先行する残基の脂肪族炭素原子との間の結合性を提供する。^[14]

この実験は、残基のアミドと、先行する残基の脂肪族炭素に結合した水素原子との間の結合性を示します。

この実験は、アミド共鳴を先行する残基のHαとHβと相関させる。^[15]

実験のペアは通常、HNCACB と CBCA(CO)NH のペア、または HNCA と HNC(CO)CA などの順次割り当てに使用されます。スペクトルは通常、ピークのストリップとして分析され、実験のペアからのストリップは、並べて表示することも、2 つのスペクトルのオーバーレイとして表示することもできます。HNCACB スペクトルでは、各ストリップに通常 4 つのピーク (1 つの残基の Cα と Cβ およびその前の残基のピーク) が存在します。前の残基のピークは、CBCA(CO)NH 実験から識別できます。したがって、各ピークのストリップは、隣接する残基の次のピークのストリップにリンクできるため、ストリップを順次接続できます。残基の種類は、ピークの化学シフトから識別できます。セリン、トレオニン、グリシン、アラニンなど、他のものよりもはるかに簡単に識別できるものもあります。次に、ピークの配列をタンパク質のアミノ酸配列と比較することによって共鳴を割り当てることができます。

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