細胞活動を記録する光遺伝学的手法

オプトジェネティクスは、例えばチャネルロドプシンを使用して光でニューロンの活動を変化させる方法から始まりました。より広い意味では、オプトジェネティクスのアプローチには、蛍光や生物発光を測定することでニューロンや他の細胞タイプの活動をモニターするための遺伝的にコード化されたバイオセンサーの使用も含まれます。遺伝的にコード化されたカルシウム指示薬（GECI）はニューロンの活動をモニターするために頻繁に使用されますが、膜電圧やセカンドメッセンジャーの活動など、他の細胞パラメータも光学的に記録できます。オプトジェネティクスセンサーの使用は神経科学に限定されず、免疫学、心臓病学、癌研究でもますます重要な役割を果たしています。

タンパク質発現を介して細胞内カルシウム濃度を測定する最初の実験は、オワンクラゲ由来の発光タンパク質であるエクオリンに基づいていました。しかし、この酵素が光を生成するには、燃料化合物であるセレンテラシンが必要であり、これを調製物に加える必要があります。これは無傷の動物では実用的ではなく、さらに、発光イメージングの時間分解能は比較的低いです（数秒から数分）。動物の活動を画像化するために使用された最初の遺伝子コード化蛍光カルシウム指示薬（GECI）は、 1997年に宮脇篤、ロジャー・ツィエン、および同僚によって設計されたカメレオンでした。 ^{[1]カメレオンは、レックス・カー、ウィリアム・シェーファー、および同僚によって、}線虫C.エレガンスのニューロンと筋肉細胞からの記録に動物で初めて成功しました。^{[2]カメレオンはその後、ハエ[3]}とゼブラフィッシュの神経活動の記録に使用されました。^{[4]哺乳類において、}生体内で使用された最初のGECIはGCaMP ^[5]であり、2001年に中井純一らによって初めて開発されました。^{[6] GCaMPは、}ジャネリアファーム研究キャンパス（GENIEプロジェクト、HHMI ）の科学者チームによって特に多くの改良が加えられ、特にGCaMP6 ^[7]は神経科学で広く使用されるようになりました。ごく最近では、Gタンパク質共役受容体を利用して、さまざまな神経伝達物質の非常に特異的な一連の指標が生成されています。^{[8] [9]}

遺伝子コード化センサーは融合タンパク質であり、リガンド結合ドメイン（センサー）と蛍光タンパク質で構成され、短いリンカー（柔軟なペプチド）で結合しています。センサードメインが適切なリガンドに結合すると、構造が変化します。この動きは蛍光タンパク質に伝わり、結果として生じる変形が蛍光の変化につながります。このプロセスの効率はリンカー領域の長さに大きく依存し、これは労働集約的なプロセスで最適化する必要があります。蛍光タンパク質は多くの場合、循環的に並べ替えられ、つまり新しいC 末端とN 末端が作成されます。単一波長センサーは定性測定には簡単に使用できますが、リガンド濃度の定量測定では較正が困難です。

2 番目のクラスのセンサーは、異なる色の 2 つの蛍光タンパク質 (FP) 間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET) に依存します。波長の短い FP (ドナー) は、レーザーまたは LED からの青色光で励起されます。2 番目の FP (アクセプター) が非常に近い場合、エネルギーはアクセプターに伝達され、黄色または赤色の蛍光が生じます。アクセプター FP がさらに離れると、ドナーは緑色の蛍光を発します。センサー ドメインは通常、2 つの FP 間でスプライスされ、リガンド結合時にヒンジ型の動きが生じ、ドナーとアクセプター間の距離が変わります。FRET センサーの場合、イメージング手順はより複雑ですが、蛍光比を較正してリガンドの絶対濃度を測定できます。FRETプロセスによって蛍光減衰が加速されるため、ドナー蛍光の蛍光寿命イメージング(FLIM) による読み出しも可能です。

• 特定の細胞クラス（アストロサイトや錐体細胞など）をターゲットにすることができる。これにより、空間分解能のない光学的な読み出しが可能になり、例えば脳深部からのファイバー測光などが可能になる。 ^[10]
• 指示タンパク質を特定のアンカードメイン、保持シグナル、または細胞内小体と融合させることにより、細胞内区画（シナプス、細胞小器官、核など）を標的とすることができます。
• さまざまな種（線虫、昆虫、魚、哺乳類）および細胞培養システム（FLIPRアッセイ）で機能します。
• ウイルスベクター（例： rAAV）によって送達することができる
• 数千のニューロンの活動を同時に記録することができる^[11]

• 測定されたイオンまたはタンパク質を緩衝し、細胞シグナル伝達を妨げる可能性がある。
• 光退色を起こしやすく、長期的な測定に支障をきたす。
• 非常に高濃度で発現すると有毒となる可能性がある
• 高感度カメラやレーザー走査顕微鏡が必要
• いくつかのGPCRベースのセンサーは偏光に敏感である^[12]
• ほとんどの指標は緑色蛍光であるため、複数の細胞パラメータを同時に測定することは困難です（多重化）。

指示薬は、イオン濃度、膜電位、神経伝達物質、およびさまざまな細胞内シグナル伝達分子を測定するために設計されています。次のリストは、各クラスの例のみを示しています。他にも多数の指示薬が公開されています。

• 遺伝子組み換えカルシウム指示薬（GECI）：天然カルシウム結合タンパク質（カルモジュリン、トロポニン）をベースにしたツールの大きなクラス。さまざまな親和性、速度論、色（緑、赤）が利用可能。蛍光強度（単波長指示薬）、 FRETまたはBRETを介して読み出します。さまざまな細胞小器官をターゲットにしています。現在のバージョン：JGCaMP8 ^[13]
• 遺伝子組み換え塩化物指示薬：クロメレオン^[14]
• 遺伝子組み換えカリウム指標：GINKO2 ^[15]
• 細胞内pHの遺伝的にコード化された指標（GEPhI）：CypHer ^[16]
• 遺伝子コード化電圧インジケーター（GEVI）：ArcLight ^[17]
• 遺伝子組み換え小胞融合センサー：シナプト-pHluorin、シナプトフィジン-pHluorin ^[18]
• 遺伝子組み換えcAMPセンサー：EPAC ^[19]
• 遺伝子組み換えATPセンサー：QUEEN-37C ^[20]
• 遺伝子組み換えキナーゼ活性センサー：CaMui、^[21] SmURFP
• 遺伝的にコード化された小型Gタンパク質センサー：FRas ^[22]

• 遺伝的にコード化されたグルタミン酸センサー： GluSnFR ^[23]
• 遺伝子組み換えGABAセンサー：iGABASnFR ^[24]
• 遺伝子組み換えドーパミンセンサー：dLight1、^[25] GRAB-DA ^[26]
• 遺伝子組み換えセロトニンセンサー：GRAB _5-HT、^[27] sDarken、^[28] iSeroSnFR ^[29]
• 遺伝子組み換えノルエピネフリンセンサー：GRAB _NE ^[30]
• エンドカンナビノイド活性の遺伝子組み換えセンサー：GRAB _eCB2.0 ^[31]
• オレキシン/ヒポクレチン神経ペプチドの遺伝子組み換えセンサー：OxLight1 ^[32]
• 遺伝子組み換え乳酸センサー：eLACCO1.1 ^[33]

神経調節薬のためのGPCRベースの遺伝的にコード化された蛍光指標に関する最近のレビュー^[9]

• 蛍光バイオセンサーデータベースは、UCSDのJin Zhangの研究室が管理する、公開されているセンサーとその基本特性のかなり完全な検索可能なリストです。^[34]
• 非営利のプラスミドリポジトリであるAddgeneで入手可能な蛍光バイオセンサー。