ゲシュタルト

系統追跡のための合成ターゲットアレイのゲノム編集（GESTALT）は、多細胞システムにおける細胞の発生系統を決定するために使用される方法です。^{[1] GESTALTでは、} CRISPR / Cas9ターゲットサイトを一定間隔で含む小さなDNAバーコードを前駆細胞のゲノムに導入します。バーコードとともに、Cas9とsgRNAが細胞に導入されます。バーコードの変異は細胞分裂の過程で蓄積され、細胞のバーコードの変異のユニークな組み合わせは、DNAまたはRNAの配列決定によって決定され、発生系統にリンクされます。

運命マッピングは、成体組織の胚起源を特定するプロセスです。系統追跡はより具体的で、単一または少数の細胞から発生する子孫を調べる方法を網羅しています。^[2]最初に開発された系統追跡方法の1つは、初期胚の特定の細胞に染料を注入し、細胞分裂ごとにそれらの細胞とその子孫にラベルを付けるというものでした。^[3]その後の方法はレトロウイルス標識を使用し、レトロウイルスを使用して蛍光タンパク質やベータガラクトシダーゼなどのマーカー遺伝子を対象細胞のゲノムに導入し、それらの細胞とその子孫でマーカーを構成的に発現させました。^[4]これらの方法には、侵襲性があり、どの細胞を標識するかをターゲットにするのが比較的難しいという欠点があります。^{[2]現在、最も広く使用されているアプローチは、}遺伝子組み換えシステムによる細胞標識です。これらの方法はリコンビナーゼを使用するが、主なものとしてはCre-loxPシステムとFlp-firtシステムがあり、それぞれloxP部位とfrt部位に挟まれたDNAセグメントを削除できる。^{[5] [6]}この方法では、Creリコンビナーゼを発現でき、 loxP部位に挟まれた上流ストップカセットを持つレポーター遺伝子を持つトランスジェニックモデルが作成される。Cre組換えによりレポーター遺伝子の上流のSTOPカセットが削除され、レポーターの発現が可能になる。^[7]標識された細胞に対する空間制御は、選択したマーカー遺伝子の制御要素の下にある特定のCre対立遺伝子を使用することで実現され、誘導性Cre対立遺伝子を使用すると時間的制御が得られる。^[7]たとえば、CreERTはタモキシフェンの投与時にのみ活発な組換え活性を示す。^[8]強力ではあるが、単一細胞系統の追跡を容易にするために大幅な最適化が必要であり、スループットが低い。^[9]シーケンシングに基づく系統追跡法は、細胞運命の追跡において非常に高い解像度とハイスループットを実現するため、登場し始めている。^{[9] [10]}初期のアプローチでは、細胞系統関係を特定するために自然に発生する体細胞変異を利用していた。^[11]

GESTALTはCRISPR-Cas9システムを活用しており、これにより、sgRNAの配列に基づいて、DNAの二本鎖切断をPAMモチーフに隣接する非常に特異的な部位に標的とすることができます。^[12]これらの切断は、内因性の細胞DNAメカニズムの1つである非相同末端結合DNA修復、または相同性誘導修復によって修復されます。^[12]非相同末端結合は2つの修復経路のうちより活性が高く、標的部位でインデルが発生します。 ^[13] GESTALTシステムは10個のCRISPR / Cas9ターゲットのアレイを使用し、最初のサイトは設計されたsgRNAに対して完全な特異性を持ち、他の9つのサイトはsgRNAとのミスマッチのためにCas9活性が低くなります。^[1]このアレイを持つ細胞にCRISPR-Cas9試薬を導入すると、アレイの各ターゲットにインデルが蓄積され、細胞に固有のバーコード配列が付けられ、DNAまたはRNAシーケンシングによってその細胞とその子孫を識別するために使用できます。^[1]

標的配列はプロトスペーサーとPAM配列を含む23bpの長さです。標的配列は3～5bpのリンカー配列で区切られた連続した配列に配置されています。標的配列の特異性を保証するために、各標的配列を宿主生物のゲノムに対してスクリーニングする必要があります。各標的部位でのCas9活性はGUIDE-seqアッセイを使用して評価できます。^[14]

細胞のゲノムにバーコードアレイを導入するには、2つの異なる方法が用いられる。最初の方法は、EGFPの3'-UTRに挿入されたバーコードアレイを含むレンチウイルス構造を前駆細胞に導入する。これにより、バーコードアレイがゲノムに組み込まれ、EGFPの安定した発現によってバーコード細胞がマークされる。2番目の方法は、トランスジェニック動物株を作成することである。このトランスジェニックモデルは、ユビキチンプロモーターの制御下でDsRedの3'-UTRにクローン化されたバーコードアレイを含むTol2トランスジェネシスベクターを使用して以前に生成された。^{[15] [追加の引用が必要]}

バーコード編集と細胞の標識の開始は、Cas9タンパク質とsgRNAを前駆細胞に導入することによって行われます。CRISPR-Cas9複合体は、バーコード領域でランダムに二本鎖切断を生成し、その後のNHEJ修復によってランダムなインデルが導入され、標識時に各細胞のバーコード領域に固有のDNA配列が生成されます。CRISPR-Cas9試薬を細胞に送達する方法は複数あり、活発な研究分野です。^{[16] CRISPR-Cas9試薬は、}脂質ナノ粒子を使用したトランスフェクションによって細胞に導入できます。^[16]あるいは、 CRISPR-Cas9試薬のマイクロインジェクションを1細胞胚に行うことができます。^[17] CRISPR-Cas9試薬の送達は、標識された集団を変更するために、異なる発達時期に行うことができます。バーコード編集は、送達後数時間持続する場合があります。^[1]

CRISPR-Cas9 試薬の送達後、バーコードの編集とさらなる開発のための時間が与えられ、その結果、標識された集団が拡大し、その子孫に固有のマーキングが施される。その後、ゲノム DNA または RNA を子孫細胞または目的の組織から抽出し、バーコードをPCR増幅することができる。固有の分子識別子を使用して PCR バイアスを補正するため、各 UMI バーコード コンボは単一の細胞からのものである。その後、すべてのバーコード アレルをNGSで配列決定し、特定されたアレルのセット全体を系統解析にかけ、バーコードの類似性に基づいて細胞系統を特定することができる。配列エラーを制御するために、次世代シーケンシングに固有の配列エラーのほとんどは塩基置換であるため、インデルのみを考慮することができる。^{[18] [1]}

シングルセルGESTALT（scGESTALT）は、 scRNA-seqを使用してバーコードとトランスクリプトーム情報の同時キャプチャを統合することで、GESTALTシステムを拡張します。^[19] scGESTALTでは、バーコードは誘導性プロモーターの下流で目的の前駆細胞にクローニングされます。発達期間が完了すると、バーコードの発現が誘導され、バーコードmRNAはscRNA-seqを使用してトランスクリプトームの残りの部分と一緒に配列決定されます。^[19]トランスクリプトームデータを使用して細胞タイプの分化を追跡できる一方で、バーコードを使用して他の細胞と発達関係を作成できます。 さらなる改善点は、2つの異なる時点でラベリングを誘導できることです。これは、ヒートショックプロモーター下でのCas9 / sgRNAのクローニングによって可能になります。最初のラベリングイベントは、従来のGESTALTのようにマイクロインジェクションによって誘導され、その後の2番目のラベリング期間は、ヒートショック誘導によるCas9およびsgRNAの発現によって開始されます。^[19]これにより、ゲシュタルト法では不可能だった発達段階の後期における系統追跡が可能になります。

• GESTALTは初期胚発生に限定されている。なぜなら、Cas9とsgRNAのマイクロインジェクションは少数の始原細胞に対してのみ実行可能であるためである。^[1]その結果、バーコード編集は初期発生に限定され、後の系統関係を解読することは不可能である。この制限は、誘導性Cas9およびsgRNA発現システムを用いたscGESTALTおよび関連手法の開発によって部分的に解決され、後期発生時点での標識が可能になった。^[19]
• GESTALTのバーコード配列だけでは、バーコードが識別された細胞の種類に関する情報は提供されません。scGESTALTは、バーコードを細胞のトランスクリプトームにリンクすることでこの課題に対処し、細胞のアイデンティティを決定できるようにします。^[19]
• 一部の細胞では、重複した欠失によりバーコード領域に以前に蓄積されたマークが失われ、系統情報が失われる可能性があります。^[1]
• 2つの異なる系統に属する細胞で偶然に類似または同一の編集が発生し、それらの系統が誤って関連付けられる可能性があります。^[1]
• scGESTALTは、単一細胞法で観察されるのと同じドロップアウトの問題を抱えています。^[20]バーコード配列は30%の細胞でのみ捕捉されます。^[19]さらに、一部の細胞タイプではバーコード構造の発現が抑制され、その結果、その細胞タイプの系統情報が失われる可能性があります。^[9]

GESTALTは当初、ゼブラフィッシュの成体器官系への胚前駆細胞の寄与を調べるために開発されました。^[1]器官系のバルク抽出物からバーコードを配列決定したところ、各器官は少数のバーコード対立遺伝子しか持たないことがわかりました。これは、器官が少数の初期前駆細胞のクローン増殖から発生したことを示しています。^[1]この実験では、何千もの分化細胞の系統情報が取得され、GESTALTのハイスループット系統追跡能力が実証されました。^[1]

scGESTALTはゼブラフィッシュ脳の系統樹を改良するために使われてきました。^[19]脳を横切って移動する細胞を生み出す多能性前駆細胞の存在は、前脳、中脳、後脳の細胞集団でいくつかのバーコード配列が捕捉されたscGESTALT実験の後に発見されました。 ^[19] scRNA-seqデータを使用して生成された、オリゴデンドロサイト前駆細胞からオリゴデンドロサイト、およびatoh1c ^{+前駆細胞から}pax6b ⁺ニューロンへの疑似時間軌跡は、これらの細胞タイプ間のバーコード分布と一致することがわかりました。^[19]

• MEMOIR（Memory by Engineered Mutagenesis with Optical In Situ Readout）は、Cas9/gRNAによるバーコードの改変を利用した関連系統追跡法です。^[21] GESTALTとの大きな違いは2つあります。第一に、バーコードに変異を導入するのではなく、MEMOIRではCas9-sgRNAがバーコードの領域を削除します。第二に、従来のシーケンシングの代わりに、MEMOIRはシーケンシャルマルチプレックス単一分子RNA蛍光ハイブリダイゼーション（seqFISH）を使用して、単一細胞内のバーコードをその場で読み取ります。
• ユビキタス配列のヌクレアーゼ活性化編集による系統追跡（LINNAEUS）は、scGESTALTを改良する試みです。^[22] LINNAEUSでは、バーコードがCas9/sgRNAの標的となる複数のトランスジェニックレポーター遺伝子に置き換えられます。レポーター遺伝子はゲノム全体に広がっており、後続のCas9編集が以前の編集を上書きしないことを保証します。
• ScarTraceはscGESTALTと同じ原理に基づいた手法である。ヒストン-緑色蛍光タンパク質（GFP）トランスジーンの8つの直列コピーからなるバーコードをCas9/sgRNAで編集することで細胞系統を追跡する。^[23] ScarTraceは細胞タイプ分析のためにscRNA-seqデータを統合するが、scGESTALTのようにmRNAからバーコードを配列するだけでなく、ScarTraceはネストPCRも使用してgDNAからバーコードを増幅する。mRNAバーコードは不安定であったり、状況によってサイレンシングされたりする可能性があるため、これはより信頼性が高いとされている。^[23]