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分子生物学において、ライブラリとは、分子クローニングのプロセスを通じて微生物の集団に保存され、増殖される遺伝物質フラグメントのコレクションです。DNAライブラリには、cDNAライブラリ（逆転写RNAから形成）、ゲノムライブラリ（ゲノムDNAから形成）、ランダム化変異ライブラリ（代替ヌクレオチドまたはコドンが組み込まれたde novo遺伝子合成によって形成）など、さまざまなタイプがあります。DNAライブラリ技術は、現在の分子生物学、遺伝子工学、タンパク質工学の主力であり、これらのライブラリの用途は、元のDNAフラグメントのソースによって異なります。ライブラリの準備に使用されるクローニングベクターと技術には違いがありますが、一般的に各DNAフラグメントはクローニングベクターに一意に挿入され、その後、組換えDNA分子のプールが細菌の集団（細菌人工染色体またはBACライブラリ）または酵母に移され、各生物は平均して1つの構成体（ベクター+挿入）を含みます。生物の集団が培養されて成長すると、その中に含まれる DNA 分子がコピーされ、増殖します (つまり、「クローン化」されます)。
用語
「ライブラリ」という用語は、クローニングベクターに挿入された DNA 分子をそれぞれが持つ生物の集団、またはクローン化されたベクター分子すべての集合を指す場合があります。
cDNAライブラリ
cDNAライブラリは、特定のソース (細胞の集合、特定の組織、または生物全体) から精製されたmRNAのサンプルを表し、逆転写酵素を使用して DNA テンプレートに戻されています。したがって、mRNA が精製されたときの生理学的、発達的、または環境的条件下で、その特定のソースで活発に転写されていた遺伝子を表します。cDNA ライブラリは、「完全長」クローンを促進する技術を使用して、または「発現配列タグ」の識別に使用される短いフラグメントを生成する条件下で生成できます。
cDNA ライブラリは逆遺伝学には役立ちますが、特定の生物のゲノム全体のごく一部 (1% 未満) しか表しません。
cDNA ライブラリの用途には以下が含まれます。
- 新規遺伝子の発見
- 遺伝子機能のin vitro研究のための全長cDNA分子のクローニング
- さまざまな細胞や組織で発現するmRNAのレパートリーの研究
- 異なる細胞や組織における選択的スプライシングの研究
ゲノムライブラリ
ゲノムライブラリとは、特定の生物のゲノム全体を表すクローンのセットです。ゲノム ライブラリを構成するクローンの数は、(1) 対象のゲノムのサイズと (2) 特定のクローニング ベクターシステムで許容される挿入サイズによって決まります。ほとんどの実用的目的において、ゲノム DNA の組織ソースは重要ではありません。なぜなら、体の各細胞には実質的に同一の DNA が含まれているからです (いくつかの例外はありますが)。
ゲノムライブラリの用途には以下が含まれます。
- 特定の生物の完全なゲノム配列を決定する（ゲノムプロジェクトを参照）
- 遺伝子工学による遺伝子組み換え動物の作製のためのゲノム配列のソースとしての機能
- 試験管内調節配列 の機能の研究
- がん組織における遺伝子変異の研究
合成変異体ライブラリ
上で説明したライブラリの種類とは対照的に、変異遺伝子のライブラリを作成するためのさまざまな人工的な方法があります。[1]遺伝子全体の変異は、エラーを起こしやすいPCR、[2] 類似の遺伝子の一部を再結合するDNAシャッフル、 [3]またはインデルを導入するトランスポゾンベースの方法によってランダムに導入できます。[4]あるいは、デノボ合成または飽和突然変異誘発 中に特定のコドンを標的にして変異を起こし、制御された方法で遺伝子の1つ以上の点変異体を構築することもできます。 [5]これにより、元の遺伝子の変異体を表す二本鎖DNA分子の混合物が生成されます。
これらのライブラリから発現したタンパク質は、好ましい特性（安定性、結合親和性、酵素活性など）を示す変異体を見つけるためにスクリーニングすることができます。これは、遺伝子変異体の作成と発現産物のスクリーニングを指向性進化プロセスで繰り返すサイクルで行うことができます。[1]
cDNAライブラリ作成技術の概要
DNA抽出
mRNA ライブラリ (つまり cDNA クローン) を作成する場合、全長 mRNA を分離するためのプロトコルはいくつかあります。ゲノム DNA (gDNA とも呼ばれる) ライブラリ用の DNA を抽出するには、DNA ミニプレップが役立つ場合があります。
挿入準備
cDNA ライブラリでは、mRNA の完全長クローンが cDNA (後でベクターに挿入される) としてキャプチャされるように注意する必要があります。このため、1 番目の cDNA 鎖と 2 番目の cDNA 鎖の合成を最適化し、ベクターへの方向性クローニングの可能性を高めるために、いくつかのプロトコルが設計されています。
gDNA 断片は、非特異的な頻繁な切断制限酵素を使用して、抽出された gDNA から生成されます。
ベクトル
対象となるヌクレオチド配列は、細菌細胞に感染するために使用された プラスミドまたはバクテリオファージのゲノムへの挿入物として保存されます。
ベクターは、細菌細胞で最も一般的に増殖しますが、YAC (酵母人工染色体) を使用する場合は、酵母細胞を使用することもできます。ベクターはウイルスでも増殖できますが、時間がかかり面倒です。ただし、ウイルス (多くの場合、ファージ) を使用すると、高いトランスフェクション効率が得られるため、ベクター (連結された挿入物を含む) をパッケージ化して、細菌 (または酵母) 細胞に導入するのに便利です。
さらに、cDNA ライブラリ用に、Lambda Zap II ファージ、ExAssist、および 2 つの E. coli 種を使用したシステムが開発されています。loxP サイトとリコンビナーゼ酵素の in vivo 発現を使用した Cre-Lox システムも代わりに使用できます。これらは in vivo 切除システムの例です。in vitro 切除には、従来の制限酵素とクローニング戦略を使用したサブクローニングが含まれます。in vitro 切除は、in vivo 切除システムよりも時間がかかり、より多くの「実践的な」作業が必要になる場合があります。いずれの場合も、システムにより、ベクターをファージから生細胞に移動でき、そこでベクターは、ライブラリが使用されるまで複製および増殖できます。
ライブラリの使用
これには、関心のある配列の「スクリーニング」が含まれます。これを実現するには複数の方法があります。
参考文献
- ^ ab Wajapeyee, Narendra; Liu, Alex Y.; Forloni, Matteo (2018-03-01). 「エラーを起こしやすいDNAポリメラーゼを用いたランダム突然変異誘発」Cold Spring Harbor Protocols . 2018 (3): pdb.prot097741. doi :10.1101/pdb.prot097741. ISSN 1940-3402. PMID 29496818.
- ^ マッカラム、エリザベス・O.ウィリアムズ、ベレア AR;チャン・ジンレイ。 Chaput, John C. (2010)、Braman, Jeff (編)、「エラープローン PCR によるランダム変異誘発」、In Vitro Mutagenesis Protocols: Third Edition、Methods in Molecular Biology、vol. 634、Humana Press、pp. 103–109、doi :10.1007/978-1-60761-652-8_7、ISBN 9781607616528、PMID 20676978
- ^ Crameri A、Raillard SA、 Bermudez E、 Stemmer WP (1998 年 1 月)。「多様な種の遺伝子ファミリーの DNA シャッフルが指向性進化を加速」 。Nature。391 ( 6664 ): 288– 91。Bibcode :1998Natur.391..288C。doi : 10.1038/34663。PMID 9440693。S2CID 4352696 。
- ^ Jones DD (2005 年 5 月). 「標的遺伝子のランダムな位置でのトリプレットヌクレオチド除去: TEM-1 ベータラクタマーゼのアミノ酸欠失に対する耐性」. Nucleic Acids Research . 33 (9): e80. doi :10.1093/nar/gni077. PMC 1129029. PMID 15897323 .
- ^ ワン・ティエンウェン;朱、胡。マー・シンユアン。チャン、ティン。マ、ユウシュウ。魏、東志 (2006-09-01)。 「指向性分子進化における変異体ライブラリー構築」。分子バイオテクノロジー。34 (1): 55–68 .土井:10.1385/MB:34:1:55。ISSN 1559-0305。PMID 16943572。S2CID 44393645 。