クローン3

G1/S特異的サイクリンCln3は、 CLN3遺伝子によってコード化されるタンパク質である。Cln3タンパク質は出芽酵母のG1サイクリンであり、有糸分裂細胞周期の開始点であるStartのタイミングを制御する。これは他のG1サイクリンの上流調節因子であり^[1] 、細胞増殖と細胞周期の進行を結び付ける重要な調節因子であると考えられている。^{[2] [3]} これは65kDの不安定なタンパク質であり^[4] 、他のサイクリンと同様に、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）に結合して活性化することで機能する。^[5]

Cln3 は、出芽酵母がG1/S 移行に移行し、有糸分裂のサイクルに入る時点であるStartを制御します。このプロセスを制御する遺伝子として初めて特定されたのは 1980 年代で、過去数十年にわたる研究により、その機能のメカニズムが理解されてきました。^{[引用が必要]}

CLN3遺伝子はもともと、サッカロミセス・セレビシエの小型変異体のスクリーニングでwhi1-1対立遺伝子として同定された（サイズ制御におけるCln3の役割については下記参照）。^{[6] [7]このスクリーニングは、}分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベでの同様の研究に触発されたもので、この研究ではWee1遺伝子が正常な細胞サイズを維持する細胞周期進行の阻害剤として同定された。^[8]そのため、WHI1遺伝子は当初、ポンベのWee1と同様のサイズ制御機能を果たすと考えられていた。しかし、後にWHI1は実際にはStartの正の調節因子であることが判明し、その欠失により細胞がG1期で遅延し、野生型細胞よりも大きく成長することが判明した。^{[9] [10]}元々のWHI1-1アレル（優性アレルであるためwhi1-1から変更）には、Whi1タンパク質から分解を促進するPEST配列を除去し、G1の進行を加速させるナンセンス変異が含まれていました。 ^{[4] [9]さらに、} WHI1はサイクリンホモログであることが判明し、 ^[9] WHI1 （ CLN3と改名）と以前に特定されたG1サイクリンCLN1およびCLN2を同時に削除すると、永久的なG1停止を引き起こすことが示されました。^{[11] [12]}これは、3つのG1サイクリンが出芽酵母のStartエントリーを制御する役割を担っていることを示しています。 ^[要出典]

3 つの G1 サイクリンは協力して酵母細胞を G1-S 遷移、つまりS 期に移行させてDNA 複製を開始させます。G1-S 遷移を制御する遺伝子制御ネットワークの現在のモデルを図 1 に示します。

この移行におけるG1サイクリンの主な標的は、転写因子SBFとMBF（図には示されていない）^{[13] [14] [15] [16]}と、B型サイクリン阻害剤Sic1である。^[17] Cln-CDKは、プロモーターに結合したSBFと関連する阻害剤Whi5 をリン酸化して核輸出を促進することにより、SBFを活性化する。 ^{[18] [19] [20] [21] [22]} MBF活性化の正確なメカニズムは不明である。 これらの転写因子は一緒になって、S期の生化学的活動を実行するために必要なタンパク質をコードする200を超える遺伝子の発現を促進する。^{[23] [24]}これらには、CDKに結合してS期標的をリン酸化しかし、Clb5,6-CDK複合体はSic1によって阻害されるため、S期の開始が完全に進行するにはCln1,2-CDKによるSic1のリン酸化と分解が必要である。^[17]

3つのG1サイクリンはすべてStartとG1-S遷移の正常な調節に必要ですが、Cln3活性がS期開始の決定因子であると思われます。Cln1とCln2は、Cln3に基づくStart移行の決定を作動させる役割を果たします。Cln3活性がCln1とCln2の発現を誘導することが早い段階で判明しました。さらに、Cln3はCln1やCln2よりも強力なStart移行活性化因子でしたが、Cln3-CDKは他のClnよりも本質的に弱いキナーゼ活性を持っていました。これは、Cln3がCln1とCln2の上流調節因子であることを示しています。^[1]さらに、図1に示すように、Cln1とCln2はSBFを介して自身の転写を活性化し、急速な活性化とS期への移行に寄与する正のフィードバックループを完成させることがわかりました。 ^{[25] [26]}このように、Start遷移は、Cln3-CDK活性が十分なレベルに達してCln1,2正のフィードバックループを誘導することに依存しているようであり、これによりSBF/MBFとCln1,2活性が急速に増加し、スイッチのようなG1-S遷移が可能になります。このプロセスにおける正のフィードバックの役割は疑問視されてきましたが、[ ^{27] [28]}最近の実験では、S期への移行の分子基盤であるWhi5の急速な不活性化と核輸出にとってその重要性が確認されています。[ ^{29 ]}

上で述べたように、Cln3 はもともと出芽酵母細胞の大きさの調節因子として特定されました。Start を制御するメカニズムの解明により、細胞の大きさと細胞周期の進行を結び付ける手段が明らかになりましたが、実際に細胞の大きさを感知する方法については疑問が残ります。^{[引用が必要]}

特定の種類の細胞は大きさが似ているという単純な観察と、この類似性がどのようにして維持されるのかという疑問は、長い間細胞生物学者を魅了してきました。出芽酵母の細胞サイズの制御に関する研究は、出芽酵母の細胞周期の調節がリー・ハートウェルとその同僚によって初めて解明された1970年代半ばに本格的に始まりました。1977年の独創的な研究により、酵母細胞は細胞周期の開始（出芽によって評価）を閾値サイズまで成長するまで遅らせることで、一定のサイズを維持していることがわかりました。^{[31] [32]}その後の研究でこの結果が改良され、 G1-S遷移の他の側面ではなく、 Startが特にサイズ閾値によって制御されていることが示されました。^[33]

Start の通過には閾値細胞サイズの達成が必要であるということは、酵母細胞が自身のサイズを測定し、その情報を使用してStart を制御できることを直接意味します。酵母細胞や他の種の細胞がサイズを測定する方法に関する好ましいモデルは、全体的な翻訳速度の検出に依存しています。基本的に、細胞の成長は、より多くのタンパク質を生成するためのリボソームの合成から構成されるため、タンパク質生成の全体的な速度は細胞サイズを反映するはずです。したがって、総タンパク質生成能力に対して一定速度で生成される単一のタンパク質は、細胞が成長するにつれてより多く生成されます。このタンパク質が細胞周期の進行を促進する場合 (酵母の場合はStart )、細胞周期の進行が翻訳速度に、したがって細胞サイズにリンクされます。重要なのは、このタンパク質は不安定である必要があるため、そのレベルは時間の経過に伴う翻訳速度ではなく、現在の翻訳速度に依存するということです。 ^[34]さらに、細胞は質量だけでなく体積も成長するため、このサイズセンサーの濃度は成長とともに一定のままであるため、その活性は細胞の成長とともに変化しないものと比較する必要があります。ゲノムDNAは、DNA複製が始まるまで一定量存在する（定義上）ため、早くからそのような標準として提案されていました^[35]。これがどのように起こるのかは、サイズ制御に関する現在の研究における大きな疑問のままです（下記参照）。

Cln3とその機能が特定される前に、蓄積された証拠から、このような翻訳サイズ感知が酵母で機能していることが判明した。まず、細胞あたりのタンパク質合成の総速度は成長とともに増加することが確認されたが、これはこのモデルの基本的な前提条件である^[36] 。その後、タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドで処理すると酵母のStartが遅れることが示され、翻訳速度がStartを制御していることが示された。^{[37] [38]最後に、この遅延はシクロヘキシミドの短いパルスでも発生することが示され、} Startには不安定な活性化タンパク質が必要であることが確認された。^[39]

出芽酵母のサイズ制御モデルでは、Start進入の閾値サイズが翻訳サイズセンサーによって検出されるため、「サイズ決定」タンパク質が必要であり、Cln3 の特性により、発見当初からこの役割の第一候補となっていた。まず、G1 の長さは Cln3 の発現および活性レベルと反比例して変化するため、これは重要なStart活性化因子であった。 ^[9]次に、細胞周期全体、特に G1 でほぼ恒常的に発現していた^{[1]。これは、サイクリン (その名前が示すように) では珍しいことで、細胞周期とともに発現が振動する。これら 2 つの特性により、Cln3 は総翻訳速度に依存する}Start活性化因子として機能できる。最後に、Cln3 は非常に不安定であることも示されており、これは翻訳サイズ決定因子の 3 つ目の必須特性である (前述のとおり)。^{[4] [5]}

このように、Cln3 は、翻訳サイズセンサーに必要な特性を示し、 Startの最も上流の調節因子であるため、出芽酵母のサイズセンサーであると思われます。しかし、その活性がどのようにしてサイズ依存的になるのかという重要な疑問が残ります。前述のように、翻訳サイズセンサーは、細胞が増殖するにつれて細胞質内で一定の濃度、つまり一定の活性を保つ必要があります。サイズを検出するために、細胞はサイズセンサー分子の絶対数を何らかの非増殖標準と比較する必要がありますが、そのような標準としてはゲノムが当然の選択です。当初、酵母は Cln3 (およびその標的であるWhi5 ) を核に局在させることでこれを実現したと考えられていました。核の容積はゲノムの内容に比例すると考えられていたため、核内の Cln3 濃度の増加は、ゲノムに対する Cln3 分子の増加を示している可能性があります。^{[2] [40] [41]}しかし、最近、核はゲノムの内容に関係なくG1中に成長することが示され、このモデルは覆されました。^{[42]最近の実験では、Cln3の活性は、SBF-} Whi5複合体とのDNA結合相互作用を介して、ゲノムDNAに対して直接滴定できることが示唆されています。 ^{[43]最後に、Cln3レベルとDNAの比較に依存しない他のモデルも存在します。1つは、}上流のオープンリーディングフレームによって引き起こされる総翻訳速度とCln3翻訳速度の間の非線形関係を仮定しています。^[44] 別のモデルは、G1終了時のCln3活性の増加は、Cln3分子を小胞体に保持するシャペロンタンパク質Ydj1の競合に依存していると示唆しています。^[45]