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CLARITY [1]は、アクリルアミドベースのハイドロゲルを組織の内部から構築して組織に結合させることで組織を透明化する手法であり、最初の論文で定義されているように、「特定の成分を新しいアクセシビリティや機能を提供する外因性要素に置き換えたハイブリッド形態への無傷の生物学的組織の変換」を表しています。 [1]抗体または遺伝子ベースのラベル付けと組み合わせると、CLARITY は臓器、特に脳のタンパク質と核酸の構造の非常に詳細な画像を可能にします。これは、スタンフォード大学医学部のKwanghun Chung とKarl Deisserothによって開発されました。[2]
CLARITY法は、ヒト乳がんの免疫腫瘍学、[3] アルツハイマー病のヒト脳、[4]マウス脊髄、[5] 多発性硬化症の動物モデル、[6]植物など、さまざまな組織や疾患状態に応用された論文がいくつか発表されています。[7] CLARITYは、共焦点拡大顕微鏡、SPIM光シート顕微鏡、CLARITY最適化光シート顕微鏡（COLM）などの新しい顕微鏡法を開発するために他の技術と組み合わせてもいます。[8]
手順
CLARITY イメージングを適用するプロセスは、死後の組織サンプルから始まります。組織の種類によっては、サンプルを固定した後、脱灰や脱色などの前処理手順が必要になる場合があります。次に、一連の化学処理を施して透明性を実現する必要があります。この処理では、サンプルの脂質成分が除去されますが、元のタンパク質と核酸はほぼすべてそのまま残ります。[1]この目的は、組織を透明にして、その構成機能部分 (主にタンパク質と核酸) の詳細な顕微鏡検査を可能にすることです。これを実現するには、既存のタンパク質構造を透明な足場に配置して、脂質成分を除去しながらそれを保存する必要があり、この「足場」はアクリルアミドなどのハイドロゲルモノマーでできています。ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどの分子を添加すると、保存するタンパク質や核酸への足場の付着が容易になり、細胞成分とアクリルアミドの間の実際の結合を確立するには熱を加えることが必要である。[9]
このステップが完了すると、標的組織の細胞のタンパク質と核酸成分はしっかりと固定され、脂質成分は分離したままになります。脂質はその後、洗剤中で受動拡散するために数日から数週間かけて除去されるか、電気泳動法によって数時間から数日に加速されます。[10] [11]電気泳動法による加速の取り組みは、組織損傷を引き起こさない能力についてはまだ結論が出ていません。通過する際に、洗剤の親油性特性により、途中で遭遇した脂質を拾い上げて除去することができます。DiIなどの親油性染料は除去されますが、CLARITYと互換性のある親油性染料は、隣接するタンパク質に固定することができます。[12]タンパク質やDNAなどの非脂質分子の大部分は、アクリルアミドゲルと関与する分子の化学的特性のおかげで、この手順の影響を受けません。[9]
最初の論文で報告されているように、このプロセス中に組織は膨張しますが、必要に応じて屈折率マッチング溶液で培養する最終段階で元の寸法に戻すことができます。[1]脂質が豊富な脳では組織の膨張が起こりますが、他の組織タイプではプロセス全体を通じてそれほど大きな組織膨張は起こらないことが知られています。
この段階では、サンプルはイメージングのために完全に準備されています。イメージングのためのコントラストは、内因性の蛍光分子、核酸（DNAまたはRNA）ラベル、または特定の標的物質に特異的に結合する抗体を使用する免疫染色から得られます。さらに、これらの抗体は、最終的なイメージング結果の鍵となる蛍光タグでラベル付けされています。標準的な共焦点、2光子、または光シートイメージング法はすべて、タンパク質の局在のスケールまで放出された蛍光を検出するのに適しており、その結果、CLARITYが生成する最終的な非常に詳細な3次元画像が得られます。[9]
サンプルを免疫染色して画像を取得した後、抗体を除去して新しい抗体を再適用することができるため、サンプルを複数回画像化し、複数のタンパク質タイプをターゲットにすることが可能になる。[13] [14]
アプリケーション
脳イメージングの観点では、CLARITYイメージングが特定の構造を非常に詳細に明らかにする能力は、局所回路配線（特にコネクトームプロジェクトに関連して）、神経細胞間の関係、細胞内構造の役割、タンパク質複合体のより良い理解、核酸と神経伝達物質のイメージングを含む将来の有望な応用の道につながっています。[1] CLARITYイメージングによる発見の一例としては、ニューロンが自分自身と隣のニューロンに接続する独特の「はしご」パターンがあり、これは動物において自閉症のような行動に関連していることが観察されています。[15]
CLARITY技術は、脳以外にもさまざまな用途に拡大しています。[16]初期の論文を基に数多くの改良が発表されており、学術界とバイオテクノロジー業界の両方で、CLARITYに幅広い用途を適用するための取り組みが行われています。CLARITYは、将来の臨床診断に強力な洞察を提供できる新興技術として、引き続き注目を集めています。CLARITYは、肝臓、膵臓、脾臓、精巣、卵巣などの他のほとんどの臓器や、ゼブラフィッシュなどの他の種をほとんどまたはまったく改造せずに除去するために使用できます。骨には簡単な脱灰ステップが必要ですが、同様に、植物組織には細胞壁の酵素分解が必要です。[10]
NIH所長フランシス・コリンズ氏はすでにこの新興技術への期待を表明しており、次のように述べている。[17]
「CLARITY は強力です。研究者は全体的な視点を失うことなく、病気や損傷を受けた構造に焦点を当てて神経疾患や障害を研究できるようになります。これは、これまで 3 次元ではできなかったことです。」
制限事項
CLARITY 法は脂質抽出後のタンパク質保持において前例のないレベルを達成しましたが、この技術では依然として洗剤電気泳動 1 回につき推定 8% のタンパク質が失われます。[13]抗体の除去は通常、元のサンプルを作成するのと同じ洗剤プロセスによって行われるため、単一サンプルを繰り返しイメージングするとこの損失が増幅されるだけです。[9]ただし、これらの計算では、実験全体にわたる全体的なタンパク質損失に対する一貫した方法が欠けているようです。Karl Deisseroth が設立した ClearLight Biotechnologies 社は、抗体除去用に最初に発表された洗剤プロセスが理想的なアプローチではないことを発見し、組織の完全性にそれほど悪影響を与えない脱色溶液を開発しました。
この技術のその他の潜在的な欠点としては、サンプルの作成と画像化にかかる時間の長さ（免疫組織化学染色だけで実行に最大 6 週間かかります）と、使用されるアクリルアミドが毒性が高く発がん性があるという事実が挙げられます。時間は、CLARITY 技術を使用する上での制限要因および欠点として頻繁に挙げられますが、いくつかの学術企業およびバイオテクノロジー企業（Logos Bioscience、ClearLight Biotechnologies）は、免疫染色の時間枠を大幅に短縮する CLARITY 試薬の開発と最適化を続けており、サンプルの種類に応じてプロセスを 6 週間から 1 週間にまで短縮しています。すべての組織の透明化には独自の安全性の問題があります。アクリルアミドは毒性があり発がん性があると考えられていますが、その成分はウェスタンブロットに使用されるゲルに含まれるものと似ています。
参照
参考文献
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