転写翻訳フィードバックループ

転写翻訳フィードバック ループ( TTFL ) は、行動と生理学における概日リズムを説明するための細胞モデルです。種を超えて広く保存されている TTFL は自己調節性であり、時計遺伝子の転写はそれ自身のタンパク質産物によって制御されます。

概日リズムは何世紀にもわたって記録されてきました。たとえば、フランスの天文学者ジャン＝ジャック・ドルトゥー・ド・メランは、ミモザの葉が24時間周期で動くことを1729年にすでに記録していました。しかし、科学は最近になってようやく、観察された概日リズムを駆動する細胞メカニズムを明らかにし始めました。概日リズムの細胞的基礎は、単細胞生物でリズムが観察されているという事実によって裏付けられています^[1]

1970 年代初頭、ロン・コノプカとその同僚らが突然変異を誘発するために順方向遺伝学的手法を用いた実験を行い、周期( Per ) 遺伝子が変化したキイロショウジョウバエの標本では周期性も変化していることが明らかになりました。遺伝学および分子生物学の実験ツールが改良されるにつれて、研究者らは正常な周期的な行動の維持に関与する遺伝子をさらに特定し、内部のリズムはコア時計遺伝子の小さなサブセットによって変更されるという概念を生み出しました。ハーディンとその同僚 (1990) は、これらのリズムを動かすメカニズムが負のフィードバック ループであると初めて提唱しました。その後の主要な発見によりこのモデルが確認されました。特に、1990 年代後半にトーマス・K・ダーリントンとニコラス・ゲカキスが主導した実験では、ショウジョウバエとマウスでそれぞれ時計タンパク質が特定され、その方法が特徴付けられました。これらの実験から、転写翻訳フィードバック ループ (TTFL) モデルが生まれ、現在ではさまざまな種の概日行動を説明する主要なパラダイムとなっています。^[2]

TTFL は負のフィードバック ループであり、時計遺伝子はタンパク質産物によって制御されます。一般的に、TTFL には、転写を促進する正の調節要素と転写を抑制するタンパク質産物という 2 つの主要なアームが関与しています。正の調節要素が時計遺伝子プロモーターに結合すると、転写が進行してmRNA転写産物が生成され、次に翻訳が進行してタンパク質産物が生成されます。mRNA 転写産物の蓄積、タンパク質の蓄積、遺伝子抑制の間には、翻訳ダイナミクス、翻訳後タンパク質修飾、タンパク質二量体化、細胞内核への移行により特徴的な遅延が生じます。^[3]種を超えて、TTFL に関与するタンパク質には、タンパク質間相互作用に関与するPAS ドメインやDNA 結合に関与するbHLH ドメインなどの共通の構造モチーフが含まれています。^[4]

十分な量の修飾タンパク質産物が細胞質に蓄積すると、それらは核に輸送され、そこでプロモーターからの正の要素を阻害して時計遺伝子の転写を停止します。時計遺伝子は、このようにして、そのタンパク質産物が分解されるまで低レベルで転写され、正の調節要素がプロモーターに結合して転写を再開できるようになります。TTFL の負のフィードバック ループには、細胞の概日時計にとって重要な複数の特性があります。まず、遺伝子の翻訳と負の調節の間の遅延によって、遺伝子転写とタンパク質の量とサイズの両方に毎日のリズムが生じます。サイクルの期間、つまり 1 つのサイクルを完了するのに必要な時間は、各個人で一定であり、突然変異がない限り、通常は 24 時間近くです。これにより、地球が経験する 24 時間の明暗サイクルへの安定した同調が可能になります。さらに、時計遺伝子のタンパク質産物は、フィードバック ループの一部ではない下流の遺伝子を制御するため、時計遺伝子は生物内の代謝などの他のプロセスで毎日のリズムを作成できます。^[3]最後に、TTFLはリミットサイクルであり、たとえ妨害されても固定された軌道に戻り、24時間周期で振動経路を維持する閉ループであることを意味します。^[5]

TTFLの存在は動物種間で高度に保存されていますが、プロセスに関与する多くの要素は、異なる種内で進化の過程で変化してきました。植物、動物、菌類、その他の真核生物を比較すると、TTFLに関与する遺伝子とタンパク質に違いがあります。これは、TTFLモデルに従う時計が生命の存在中に複数回進化してきたことを示唆しています。^[6]

TTFLは最初にショウジョウバエで発見され、そのシステムは哺乳類のTTFLといくつかの要素を共有しています。時計遺伝子Period （per）とTimeless（tim）の転写は、正の要素Cycle（dCYC）とClock（dCLK）がヘテロ二量体を形成してEボックスプロモーターに結合し、転写を開始すると開始されます。日中はTIMが分解されます。光への曝露によりCRYがTIMに結合しやすくなり、TIMがユビキチン化されて最終的に分解されます。^[7]夜間は、TIMとPERがヘテロ二量体を形成して細胞質にゆっくりと蓄積し、そこでPERがキナーゼDOUBLETIME（DBT）によってリン酸化されます。複数のリン酸基の転写後修飾は、複合体を分解の標的とし、核局在を促進します。核内では、PER-TIM二量体がCYC-CLK二量体に結合し、CYC-CLK二量体がEボックスから解放され、転写が阻害されます。PERとTIMが分解されると、CYC-CLK二量体は再びEボックスに結合して転写を開始し、負のフィードバックループを閉じます。^[8]

二次フィードバックループは、この一次フィードバックループと相互作用します。CLOCKWORK ORANGE (CWO) は E ボックスに結合して CYC-CLK の直接の競合因子として作用し、転写を阻害します。PAR-DOMAIN PROTEIN 1 ε (PDP1ε) はフィードバック活性化因子であり、VRILLE (VRI) は Clk プロモーターのフィードバック阻害剤であり、それらの発現は dCLK-dCYC によって活性化されます。エクジソン誘導タンパク質 75 (E75) はclk発現を阻害し、時間依存的にper転写を活性化します。これらの二次ループはすべて、一次 TTFL を強化するように作用します。^[8]

ショウジョウバエのクリプトクロムは青色光受容体であり、TIMの分解を引き起こし、間接的に時計の位相をリセットし、per発現の新たな促進につながります。^[8]

哺乳類のTTFLモデルには、ショウジョウバエに見られるものと相同な多くの要素が含まれています。哺乳類のシステムは、BMAL1がCLOCKとヘテロ二量体を形成し、 mPerとクリプトクロム（cry ）の転写を開始するという仕組みです。哺乳類のperiod遺伝子には、 mPer1、mPer2、mPer3という3つのパラログ（歴史的に類似していたが重複として現れた遺伝子）があります。哺乳類にはクリプトクロムのパラログも2つあります。PERとCRYタンパク質はヘテロ二量体を形成し、CK1δとCK1εによるPERのリン酸化によって二量体の核への局在が制御されます。核内では、PER-CRYがBMAL1-CLOCKに結合してEボックスプロモーターから遺伝子を放出することで、同族遺伝子の転写を負に制御します。^[8]

mPerパラログはdPerの機能的オーソログとして連携して働くが、それぞれが異なった機能を持っている。mPer1とmPer2は脳内の時計機能に必要であるが、mPer3は末梢組織の概日リズムにおいてのみ識別可能な役割を果たす。mPer1またはmPer2のいずれかをノックアウトすると周期が変化し、mPer1ノックアウトは短い周期で自由走行し、mPer2ノックアウトは元のタウと比較して長い周期で自由走行し、最終的には不整脈となる。同様に、mCry1ノックアウトは周期を短縮し、mCry2ノックアウトは周期を延長し、 mCry1 /m Cry2の二重 ノックアウトは不整脈となる。^[8]

哺乳類にも二次ループは存在するが、ショウジョウバエに見られるものよりも複雑である。ショウジョウバエのCWOと同様に、Deleted in esophageal cancer1,2 (Dec1 Dec2)はEボックスに結合してCLOCK-BMAL1が標的に結合するのを防ぎ、mPerの発現を抑制する。受容体REV-ERBとレチノイン酸関連オーファン受容体（ROR）はショウジョウバエのPDP1εやVRIと同様の役割を果たすが、CLOCKを直接制御するのではなく、CLOCKの結合パートナーであるBMAL1を制御する。D部位結合タンパク質（DBP）とE4結合タンパク質（E4BP4）はDボックスプロモーター配列に結合してmPerの発現を制御する。^[8]

これらの遺伝子がキイロショウジョウバエとどのように関係しているかは、各遺伝子の機能と進化的にどのように変化してきたかに表れています。BMAL1はCYCLEの相同遺伝子です。つまり、 BMAL1 と CYCLE は共通の歴史を持っているように見えますが、異なる種に見られます。キイロショウジョウバエと哺乳類の類似性のもう1つの例は、perとtimの機能相同遺伝子であるcryとmPerにも見られます。^[8]

Neurosporaの遺伝子周波数( frq )は、1979 年に JF Feldman と彼の同僚によって 2 番目に知られている時計遺伝子として特定されました。frq は、1989 年に CR McClung と彼の同僚によって初めてクローン化されました。 この遺伝子は、他の既知の微生物遺伝子と比較して発現が非常に複雑なため、特に興味深いものでした。White Collar-1 (WC-1) とWhite Collar-2 (WC-2) という 2 つの正の調節タンパク質は、主観的な深夜に Clock Box と呼ばれる frq プロモーターに結合して転写を活性化します。 光も FRQ 発現の誘導に重要です。 WC-1 は光色素であり、光によって WC-1 と WC-2 は近位光応答要素 (PLRE) と呼ばれる別のプロモーターに結合できます。 FRQ タンパク質は、WC-1 と WC-2 の活動を負に制御します。いくつかのキナーゼ（CK1、CK2、PRD-4/チェックポイントキナーゼ2）とホスファターゼ（PP1とPP2A）がFRQの核への移行能力とFRQ、WC-1、WC-2の安定性を制御します。^[9]

最初のTTFLモデルは2001年にシロイヌナズナで提案され、2つのMYB転写因子、LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY)、CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1)、TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (TOC1)が含まれていました。CCA1とLHYは午前中に発現し、相互作用してTOC1の発現を抑制します。CCA1とLHYの発現は暗闇で減少し、TOC1が発現してCCA1とLHYの発現を負に制御できるようになります。CCA1とLHYは自身のプロモーターに結合して自身の転写を抑制することもできます。^[10]

2 番目のループには PRR9、PRR7、PRR5 が関与しており、これらはすべて TOC1 の相同遺伝子で、CCA1 と LHY の発現を抑制します。これらの PRR 遺伝子は、LHY と TOC1 によって直接抑制されます。これらの遺伝子は、LUX ARRHYTHMO (LUX)、EARLY FLOWERING 3 (ELF3)、EARLY FLOWERING 4 (ELF4) によって形成される「イブニング コンプレックス」(EC) によっても制御されます。LUX は MYB と同様の機能を持つ転写因子ですが、ELF3 と ELF4 は機能が不明な核タンパク質です。「イブニング コンプレックス」は、LHY と CCA1 の発現を間接的に促進し、その構成要素の転写を抑制します。このモデルは、活性化につながる 2 つの阻害から構成されるため、リプレッサーとも呼ばれます。^[10]

最近発見されたループには、朝に発現し、PRR5、TOC1、LUX、ELF4などの夕方の遺伝子の転写を誘導するレヴェイユ（レヴェイユ）遺伝子ファミリーが含まれています。結果として生じるタンパク質が翻訳されると、PRR9、PRR7、およびPRR5はRVE8を抑制します。RVE8は、夜間光誘導性および時計調節性（LNK1、2、3、および4）の朝の成分とも相互作用し、LNKはRVE8に拮抗するか共活性化します。^[10]

GIGANTEA（GI）はシロイヌナズナTTFLモデルの中核部分として知られていないが、CCA1、LHY、TOC1によって抑制されている。さらに、GIはCCA1とLHYの発現を活性化する。^[10]

シアノバクテリアの時計の研究により、3つの重要な時計遺伝子、KaiA、KaiB、およびKaiCが発見されました。当初、これらのタンパク質は、mRNAとタンパク質の量とリン酸化レベルに日次パターンがあり、タンパク質が同族遺伝子に負のフィードバックを及ぼし、KaiCの過剰発現に応じて時計位相がリセットされ、相互作用によってKaiの活性が修正されることから、真核生物で提案されたものと同様のTTFLモデルに従うと考えられていました。 ^[11]これらの結果はそれぞれ、当時のTTFLの理解と一致していました。しかし、その後の研究では、リン酸化などの翻訳後修飾が時計制御にとってより重要であると結論付けられています。Kaiタンパク質のプロモーターが非特異的プロモーターに置き換えられたとき、タンパク質の特異的プロモーターへのフィードバックによって阻害が起こった場合に予想されるように、中心となるフィードバックループが中断されることはありませんでした。結果として、TTFLモデルはシアノバクテリアには不正確であると大部分が判断されました。転写制御はシアノバクテリアのリズムを動かす中心的なプロセスではない。転写および翻訳制御は存在するが、それらは時計機能に必要というよりは時計の効果であると考えられていた。^[12]

時計遺伝子の調節に関与する翻訳後フィードバックループ（PTFL）も発見されており、TTFLモデルと連携して機能することが多い。哺乳類と植物の両方において、リン酸化やアセチル化などの翻訳後修飾は、時計遺伝子とタンパク質の存在量や活性を制御している。例えば、TTFL成分のリン酸化レベルは周期的に変化することが分かっている。これらの翻訳後修飾は、分解シグナル、結合調節因子、および追加因子のリクルートメントのシグナルとして機能する可能性がある。^[13]

注目すべきことに、シアノバクテリアは、転写や翻訳とは無関係なフィードバックループで、リン酸化の24時間周期のリズミカルな変化を示します。リン酸化の概日リズムは、フィードバックループのKaiタンパク質を他の細胞機構とは無関係にATPとともに試験管に入れると観察されます。この3つのタンパク質の翻訳後システムは、毎日のリズムを駆動するのに必要かつ十分なコア発振器であることが広く認められています。^[14]シアノバクテリアのKaiシステムに加えて、哺乳類の赤血球と藻類のOstreococcus tauri細胞の両方で、ペルオキシレドキシンタンパク質の酸化が転写や翻訳とは無関係に起こることが示されており、このシステムは多くの生物で保存されていることがわかっています。^[15]ペルオキシレドキシンシステムがTTFLベースの時計と相互作用するのか、それともそれ自体が新しいPTFLベースの時計の一部なのかは明らかではありません。しかし、これらの発見は両方とも、一部の生物または細胞型では、PTFL が概日リズムを駆動するのに十分であることを示唆しています。

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