サザンブロット

サザンブロット法は、 DNAサンプル中の特定のDNA配列の検出と定量化に用いられる方法である。この方法は分子生物学で用いられる。簡単に説明すると、生物学的サンプル（血液や組織など）から精製したDNAを制限酵素で消化し、得られたDNA断片を電気泳動で分離する。電気泳動では、電流を使ってDNA断片をふるいのようなゲルまたはマトリックスに通す。これにより、小さな断片は大きな断片よりも速く移動できる。DNA断片はゲルまたはマトリックスから固体膜に移され、放射性、蛍光性、または化学タグで標識されたDNAプローブに曝露される。タグにより、DNAプローブ配列と相補的な配列を含むDNA断片をサザンブロット内で視覚化できる。^[1]

サザンブロッティングは、電気泳動で分離されたDNA断片をブロッティングと呼ばれるプロセスでフィルター膜に転写し、その後プローブハイブリダイゼーションによって断片を検出する手法を組み合わせたものである。^[2]

この方法は、1975年に初めて発表したイギリスの生物学者エドウィン・サザーンにちなんで名付けられました。 ^[3]同様の原理を採用しているがRNAまたはタンパク質を使用する 他のブロッティング 方法（ウェスタンブロット、^[4] ノーザンブロット、イースタンブロット、サウスウェスタンブロット）は、サザーンの名前からの一種のダジャレとして、後にコンパスの方角にちなんで名付けられました。ラベルが同名であるため、固有名詞の慣例に従い、サザンは大文字で始まります。他のブロッティング方法の名前も、類推によりこの慣例に従う場合があります。^[5]

サザンは、3つの技術革新を組み合わせてサザンブロット法を発明しました。1つ目は制限酵素で、ジョンズホプキンス大学のトム・ケリーとハミルトン・スミスが開発しました。これらの制限酵素は、DNAを特定の配列で切断するために使用されます。ケネスとノリーン・マレーがこの技術をサザンとして導入しました。2つ目の技術革新はゲル電気泳動で、DNA、RNA、またはタンパク質の混合物を分子の大きさに応じて分離することに基づいています。これも1971年にジョンズホプキンス大学のダニエル・ネイサンズとキャスリーン・ダナが開発しました。3つ目の技術革新はブロッティングスルー法で、フレデリック・サンガーがRNA分子をDEAE紙に転写したときに開発されました。サザンブロット法は1973年に発明されましたが、1975年まで公開されませんでした。その後公開されましたが、この技術は、サザンブロット法をコールドスプリングハーバー研究所のマイケル・マシューズという科学者に紙に描いて紹介したときに普及しました。^[6]

ゲノムDNAは1つまたは複数の制限酵素で消化され、その後DNA断片はゲル電気泳動によってサイズ分画されます。DNA断片はナイロンまたはニトロセルロース膜などの固体膜に転写される前に、まずアルカリ処理によって変性されます。^[7] DNA断片が膜上に固定された後、プレハイブリダイゼーション法を使用して非特異的プローブ結合を減らします。次に、膜上の断片は、標的DNA配列に相補的な放射性標識または非放射性標識DNA、RNA、またはオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズされます。次に、検出法を使用して標的DNAを視覚化します。^[8]

1. DNA 分離:研究対象となる DNA はさまざまな組織から分離されます。DNA の最も適した供給源は血液組織です。ただし、さまざまな組織 (毛髪、精液、唾液など) から DNA を分離することもできます。
2. DNA 消化:制限エンドヌクレアーゼは、高分子量の DNA 鎖を小さな断片に切断するために使用されます。これは、使用するプローブと DNA の複雑さに応じて変更可能な必要な量の DNA を、制限酵素、酵素バッファー、精製水とともに追加することで行われます。その後、すべてを 37 °C で一晩インキュベートします。
3. ゲル電気泳動: DNA 断片はアガロースゲル上で電気泳動され、サイズごとに分離されます。DNA 断片の一部が 15 kbより大きい場合は、ブロッティングの前にゲルを希塩酸などの酸で処理することがあります。これによりDNA 断片が脱プリン化され、DNA が小さな断片に分解されるため、ゲルから膜への転写がより効率的になります。
4. 変性:アルカリ性転写法を使用する場合、DNAゲルをアルカリ溶液(通常は水酸化ナトリウムを含む)に入れて二本鎖DNAを変性させる。アルカリ性環境での変性により、DNAの負に帯電したチミン残基と膜の正に帯電したアミノ基の結合が改善され、DNAが一本鎖に分離されてプローブとのハイブリダイゼーションが可能になる(下記参照)。また、DNAに残っている可能性のあるRNAも破壊される。ただし、アルカリ性転写法と中性転写法のどちらを選択するかは経験的な場合が多く、結果的に同等になることもある。^[要出典]
5. ブロッティング:ニトロセルロース(またはナイロン)膜のシートをゲルの上 (または下、転写の方向による) に置きます。ゲルと膜が良好かつ均一に接触するように、ゲルに常に圧力をかけます (吸引を使用するか、膜とゲルの上に紙タオルを重ねて重しを置く)。吸引で転写する場合は、20X SSCバッファーを使用して密閉し、ゲルの乾燥を防ぎます。次に、水分ポテンシャルの高い領域から水分ポテンシャルの低い領域 (通常はろ紙とティッシュペーパー) への毛細管現象によるバッファー転写を使用して、DNA をゲルから膜に移動します。DNAの負電荷と膜の正電荷により、イオン交換相互作用によって DNA が膜に結合します。DNA 断片を固体膜に転写するには、次の 5 つの方法を使用できます。^[8]
   1. 上向き毛細管転写: この方法では、DNA 断片をゲルから膜へ上向きに転写し、液体またはバッファーの流れが上向きになります。
   2. 下向きの毛細管転写: この方法は、ゲルを膜 (通常はナイロンで帯電した膜) の表面に置くことによって行われ、DNA 断片はアルカリ緩衝液の流れとともに下方向に転写されます。
   3. 2 つの膜への同時転写: この方法は、高濃度の DNA 断片をゲルから 2 つの膜に同時に転写するために使用されます。
   4. 電気泳動転写: この方法では通常、大きな電流が使用され、使用するバッファーの温度により DNA を効率的に転写することが困難になるため、これらの機械には冷却装置を装備するか、寒冷地で使用することができます。
   5. 真空転写: この方法では、上部チャンバーのバッファーを使用してゲルからニトロセルロース膜またはナイロン膜に DNA を転写し、ゲルを膜上に直接置き、膜を真空チャンバー上の多孔質スクリーン上に置きます。
6. 固定化:次に、膜を真空または通常のオーブンで 80 °C で 2 時間焼成するか (標準条件、ニトロセルロースまたはナイロン膜)、紫外線にさらして(ナイロン膜)、転写された DNA を膜に永久的に付着させます。
7. ハイブリダイゼーション:その後、ハイブリダイゼーション プローブ(ターゲット DNA 内に存在するかどうかを確認する特定の配列を持つ単一の DNA フラグメント) が膜に露出されます。プローブ DNA は、通常は放射能を組み込むか、分子に蛍光染料または発色染料をタグ付けすることによって検出できるようにラベル付けされます。場合によっては、ハイブリダイゼーション プローブは DNA ではなく RNA から作成されることがあります。サンプル DNA へのプローブの結合の特異性を保証するために、最も一般的なハイブリダイゼーション法では、膜表面とターゲット DNA をブロックするためのサケまたはニシンの精子 DNA、脱イオン化ホルムアミド、およびプローブの非特異的結合を減らすためのSDSなどの洗剤が使用されます。
8. 検出:ハイブリダイゼーション後、余分なプローブを膜から洗い流し (通常はSSC バッファーを使用)、放射性プローブまたは蛍光プローブの場合はオートラジオグラフィーによってX 線フィルム上にハイブリダイゼーションのパターンを視覚化し、発色検出法を使用する場合は膜上の色の発色によってハイブリダイゼーションのパターンを視覚化します。

プローブがフィルター膜上の特定の DNA 断片にハイブリダイズすると、この断片にプローブと相補的な DNA 配列が含まれていることが示されます。電気泳動ゲルから膜への DNA の転写ステップにより、ラベル付けされたハイブリダイゼーション プローブがサイズ分画された DNA に簡単に結合します。また、オートラジオグラフィーやその他の検出方法による分析に必要なターゲット プローブ ハイブリッドの固定も可能になります。制限酵素で消化したゲノム DNA で実行されるサザン ブロットは、ゲノム内の配列数 (遺伝子コピーなど) の決定に使用できます。制限酵素によって切断されていない単一の DNA セグメントにのみハイブリダイズするプローブは、サザン ブロットで単一のバンドを生成しますが、プローブが複数の非常に類似した配列 (配列重複の結果である可能性のある配列など) にハイブリダイズする場合は、複数のバンドが観察される可能性が高くなります。特異性を向上させ、100% 未満の同一性を持つ配列へのプローブのハイブリダイゼーションを減らすために、ハイブリダイゼーション パラメータを変更してもよい (たとえば、ハイブリダイゼーション温度を上げるか、塩含有量を下げる)。ナイロン膜はニトロセルロース膜よりも耐久性があり、DNA 断片への結合能力が高いため、膜を高温でインキュベートしても DNA 断片は膜にしっかりと固定される。さらに、DNA 断片を膜に結合させるために高イオン強度の緩衝液を必要とするニトロセルロース膜と比較して、ナイロン帯電膜はイオン強度が非常に低い緩衝液を使用して、約 50 bp の小さな DNA 断片でも膜に転写するため、通常、転写される DNA はポリアクリルアミド ゲルで分離される。ブロッティング ステップでは、DNA をゲルから膜に転写する最も効率的な方法は、より迅速かつ定量的に DNA を転写できる真空転写である。^[8]

1. サザンブロッティング転写は、標的遺伝子のタンパク質産物のアミノ酸配列に基づく相同性に基づくクローニングに使用できます。オリゴヌクレオチドは、標的配列に相補的となるように設計されます。オリゴヌクレオチドは化学的に合成され、放射性標識され、DNA ライブラリまたはクローン化された DNA 断片のその他のコレクションをスクリーニングするために使用されます。ハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズする配列は、たとえば、標的遺伝子の全長配列を取得するためにさらに分析されます。
2. この技術を用いて正常な染色体や遺伝子の再配列を研究することができる。^[7]
3. ハイブリダイゼーションの特異性を下げることで、他の種やゲノム内の類似配列を見つけるために使用できます。^[7]
4. 異なるサイズの消化DNAの混合物の中で、特定のサイズの制限断片を識別するために使用されます。 ^[7]
5. これは、挿入、再配列、欠失、制限部位に影響を与える点突然変異など、遺伝子に生じる変化を識別するのに役立ちます。 ^[7]
6. さらに、制限酵素マッピングにおいて多くの異なる制限酵素を使用する特定の領域を識別するために使用されます。また、特定の制限酵素を変化させる一塩基多型によりどの認識部位が変化したかを判断するためにも使用されます。^[7]
7. サザンブロッティングは、特定の遺伝子のメチル化部位を特定するためにも使用できます。特に有用なのは、同じ配列を認識して切断する制限酵素MspIとHpaIIです。ただし、 HpaIIではその部位のCがメチル化されている必要がありますが、MspIはその部位でメチル化されていないDNAのみを切断します。したがって、特定のプローブで分析された配列内のメチル化部位は、前者の酵素によって切断されますが、後者の酵素では切断されません。^[9]
8. 指紋による個人識別や病気の診断に利用できる。^[10]

1. 他の検査法と比較して、サザンブロット法は複数のステップからなる複雑な技術であり、これらのステップには高価な機器と試薬が必要である。^[10]
2. 高品質かつ大量のDNAが必要である。^[10]
3. サザンブロッティングは時間のかかる方法であり、半定量的な方法であるためDNAのサイズを推定することしかできない。^[10]
4. 塩基対レベルでの変異の検出には使用できません。^[10]

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