NGSデータからのSNV検出

リードカバレッジが高い理想的なエラーのない世界では、NGSデータアライメントの結果からバリアントコールを行う作業は単純です。各遺伝子座（ゲノム上の位置）で、その位置にアライメントされたリードの中で各異なるヌクレオチドの出現回数を数えることができ、真の遺伝子型は明らかになります。すべてのヌクレオチドがアレルAに一致する場合はAA、アレルBに一致する場合はBB、混合している場合はABです。しかし、実際のNGSデータを扱う場合、入力データのノイズを考慮できないため、このような単純なアプローチは使用されません。^{[ 4 ]} 塩基コールに使用されるヌクレオチドカウントには、シーケンスされたリード自体とアライメントプロセスの両方に起因するエラーとバイアスが含まれています。この問題は、リードカバレッジの深度を高くしてシーケンスすることである程度軽減できますが、これは多くの場合高価であり、多くの実用的な研究では低カバレッジデータに基づいて推論を行う必要があります。^{[ 1 ]}

確率的手法は、ノイズや推定精度向上に利用できるその他の事前情報も考慮に入れ、考えられる各遺伝子型の確率を頑健に推定することで、上記の問題を克服することを目指します。そして、これらの確率に基づいて、多くの場合MAP推定値に従って遺伝子型を予測します。

バリアントコールにおける確率的手法は、ベイズの定理に基づいています。バリアントコールの文脈において、ベイズの定理は、観測されたデータが与えられた場合に、各遺伝子型が真の遺伝子型である確率を、各遺伝子型の事前確率と、各遺伝子型が与えられた場合のデータの確率分布を用いて定義します。その式は次のとおりです。

${\displaystyle {\begin{aligned}P(G\mid D)&={\frac {P(D\mid G)P(G)}{P(D)}}\\[8pt]&={\frac {P(D\mid G)\,P(G)}{\sum \limits _{i=1}^{n}P(D\mid G_{i})\,P(G_{i})}}\end{aligned}}}$

上記の式において：

• ${\displaystyle D}$観測されたデータ、つまりアラインメントされたリードを指します。
• ${\displaystyle G}$確率が計算されている遺伝子型は
• ${\displaystyle G_{i}}$n通りの可能性のうちi番目の遺伝子型を指します。

上記の枠組みに基づくと、SNVを検出するためのさまざまなソフトウェアソリューションは、事前確率の計算方法によって異なる。${\displaystyle P(G)}$確率をモデル化するために使用される誤差モデル${\displaystyle P(D\mid G)}$、そして全体の遺伝子型を個別のサブ遺伝子型に分割し、この枠組みの中でそれぞれの確率を個別に推定することができる。^{[ 5 ]}

確率的方法の代替として、 NGSデータでバリアントコールを実行するためのヒューリスティック法が存在する。観測データの分布をモデル化してベイズ統計を使用して遺伝子型確率を計算する代わりに、最小アレル数、リード品質カットオフ、リード深度の境界など、さまざまなヒューリスティック要因に基づいてバリアントコールが行われる。確率的方法と比較すると、実際にはあまり普及していないが、境界とカットオフを使用するため、確率モデルの仮定に違反する外れ値データに対して頑健である。^{[ 9 ]}

NGSデータを用いたバリアントコール手法の設計において重要な要素の一つは、NGSリードをアラインメントする参照DNA配列です。ヒト遺伝学の研究では、HapMapプロジェクト^{[ 10 ]}などのソースから高品質の参照配列が利用可能であり、 バリアントコールアルゴリズムによるバリアントコールの精度を大幅に向上させることができます。さらに、このような参照配列は、ベイズベースの解析における事前遺伝子型確率のソースとしても利用できます。しかし、このような高品質の参照配列がない場合は、まず実験的に得られたリードをアセンブルして、アラインメント用の参照配列を作成することができます^{[ 1 ] 。}

バリアントコール実験において、エラーやバイアスの原因を取り除くために、データをフィルタリングする様々な方法が存在する。これには、アライメントを実行する前に疑わしいリードを除去したり、バリアントコールアルゴリズムによって返されたバリアントリストをフィルタリングしたりすることが含まれる。

使用するシーケンスプラットフォームによっては、シーケンスされたリードのセット内にさまざまなバイアスが存在する可能性があります。たとえば、ストランドバイアスが発生する可能性があり、これは、ある領域でアラインされたリードの順方向と逆方向の分布が非常に不均等である場合です。さらに、一部のリードの異常に高い重複が発生する可能性もあります（たとえば、PCRのバイアスによる）。このようなバイアスは疑わしいバリアントコールにつながる可能性があります。たとえば、ある遺伝子座でPCRエラーを含む断片がPCRバイアスによって過剰に増幅された場合、その遺伝子座では偽アレルが多くなり、SNVとしてコールされる可能性があります。そのため、解析パイプラインでは、これらのバイアスに基づいてコールをフィルタリングすることがよくあります。^{[ 1 ]}

最近まで、この種の分析を実行するためのソフトウェアツールは著しく未発達であり、生殖細胞系列変異を検出するために使用されるのと同じアルゴリズムに基づいていた。このような手順は、同じ個人の複数の組織サンプルに存在する遺伝子型間の統計的相関を適切にモデル化していないため、このタスクには最適化されていない。^{[ 3 ]}

最近の研究では、複数の組織サンプルからの体細胞変異の検出に特化して最適化されたソフトウェアツールが開発されています。確率的手法が開発され、各遺伝子座のすべての組織サンプルからのアレル数をプールし、すべての組織の結合遺伝子型の尤度と遺伝子型が与えられた場合のアレル数の分布に関する統計モデルを使用して、利用可能なすべてのデータを使用して各遺伝子座での体細胞変異の比較的堅牢な確率を計算できます。^{[ 3 ] [ 12 ]} さらに、この分析を実行するための機械学習ベースの手法についても最近研究が行われています。 ^{[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]}

2021年、シーケンス品質管理フェーズ2コンソーシアム^{[ 17 ]}は、コンソーシアムが参照サンプル、データ、コールセットとして確立した腫瘍細胞株と正常細胞株のペアに基づいて、サンプル調製、シーケンスライブラリキット、シーケンスプラットフォーム、バイオインフォマティクスワークフローが体細胞SNV検出の精度に及ぼす影響を調査した^多数 の研究を発表した^{[ 18 ] 。 [ 19 ]}