逆転写ループ介在等温増幅

逆転写ループ介在等温増幅法（RT-LAMP）は、RNAの特定の配列を増幅するワンステップ核酸増幅法である。RNAウイルスによって引き起こされる感染症の診断に使用されます。^[1]

これはLAMP ^[2] DNA検出と 逆転写を組み合わせ、反応を実行する前にRNAからcDNAを作成します。 ^[3] RT-LAMPは（PCRとは異なり）熱サイクル を必要とせず、60〜65℃の一定温度で実行されます。

RT-LAMP法は、 SARS-CoV-2ウイルス^[4]やエボラウイルス^[5]など のRNAウイルス（ボルチモアウイルス分類システムのグループII、IV、V ）の検出に使用されます。

RT-LAMP は、ウイルスの特定の配列に対する特定の RNA サンプルの存在をテストするために使用され、配列を大規模な外部参照データベースと比較することによって可能になります。

RT-LAMP法は、COVID-19に感染している人々の早期診断のためのRT-PCRよりも安価で簡単な代替法として支持されている。^{[6]誰でも合法的に検査を実施できる}オープンアクセスの検査設計（組み換えタンパク質を含む）がある。ラテラルフロー法による従来の迅速検査とは対照的に、RT-LAMP法ではウイルスRNAを検査することで病気の早期診断が可能になる。^[7]

検査はRNAを分離することなく行うことができ、綿棒^[8]または唾液^[9]から直接ウイルスを検出します。

RT-LAMPの使用例の1つは、最初に分離された白楊店地域にちなんで名付けられた、新しいアヒルのテンブス様BYDウイルスを検出する実験でした^{[10] [11] [1]}この方法の最近の応用としては、2013年にRT-LAMPを使用してアカバネウイルスを検出する実験があります。中国で行われたこの実験では、流産した子牛の胎児からウイルスが分離されました。^[12]

RT-LAMP法は、法医学血清学の分野でも体液の識別に使用されています。研究者らは、この方法が特定の体液を効果的に識別できることを示す実験を行いました。限界があることは承知の上で、SuらはRT-LAMP法は血液しか識別できないという結論に達しました。^{[13] [14]}

cDNA の特定の配列は、4 つの LAMPプライマーによって検出されます。そのうちの 2 つは内部プライマー(FIP と BIP) で、 Bst 酵素がテンプレートを新しい DNA にコピーするためのベースとして機能します。外部プライマー(F3 と B3) はテンプレート鎖にアニールし、反応の進行を助けます。

RT-PCRの場合と同様に、RT-LAMP法はサンプルRNAからDNAを作ることから始まります。この変換は逆転写酵素、つまりこのような変換を行うことができるレトロウイルス由来の酵素によって行われます。 ^[15] RNAから生成されたこのDNAはcDNA 、または相補DNAと呼ばれます。FIPプライマーは逆転写酵素によって使用され、一本鎖のコピーDNAを構築します。F3プライマーはテンプレート鎖のこの側にも結合し、以前に作成されたコピーを置き換えます。

この置換された一本鎖コピーは、ターゲット RNA とプライマーの混合物です。プライマーは、シーケンス自体に結合してループを形成するシーケンスを持つように設計されています。

BIP プライマーはこの一本鎖のもう一方の端に結合し、Bst DNA ポリメラーゼによって相補鎖を構築して二本鎖 DNA を作成するために使用されます。F3 プライマーはこの端に結合し、この新しく生成された一本鎖 DNA分子を再び置き換えます。

解放されたこの新しい一本鎖は、LAMP サイクリング増幅の開始点として機能します。この一本鎖 DNA は、両端が折り畳まれて自己結合し、2 つのループを形成する ダンベルのような構造をしています。

DNA ポリメラーゼと FIP または BIP プライマーは、この鎖を増幅し続け、LAMP 反応生成物が伸長します。このサイクルは、適切なプライマーを使用して、鎖の前方または後方のどちらからでも開始できます。このサイクルが開始されると、鎖は増幅プロセスの伸長段階で自己プライミング DNA 合成を受けます。この増幅は、60 ～ 65 °C の等温条件下で 1 時間以内に行われます。

RT-LAMP 検査の結果は、多くの場合、比色法で示されます。一般的な方法の 2 つは、 pHまたはマグネシウムイオンを測定することです。増幅反応により pH が低下し、Mg2+ レベルが低下します。これは、pH の場合はフェノールレッド、マグネシウムの場合はヒドロキシナフトールブルー(HNB) などの指示薬で感知できます。^[15]もう 1 つのオプションは、DNA 挿入着色剤であるSYBR Green I を使用することです。 ^[16]

この方法は、すべてを 1 つのステップで素早く実行できるため、特に有利です。サンプルはプライマー、逆転写酵素、DNA ポリメラーゼと混合され、反応は一定温度で行われます。必要な温度は、簡単な温水浴を使用して達成できます。

PCRは熱サイクリングを必要としますが、RT-LAMPは必要としないため、より時間効率が良く、非常に費用対効果に優れています。^[3]この安価で合理化された方法は、ハイテクな研究室にアクセスできない発展途上国でより容易に使用できます。

この方法の欠点は、配列特異的プライマーを生成することです。各LAMPアッセイでは、プライマーを標的DNAに適合するように特別に設計する必要があります。これは困難な場合があり、研究者が研究でLAMP法を使用することを躊躇する原因となっています。^[1]ただし、日本の富士通が開発したPrimer Explorerという無料ソフトウェアがあり、プライマーの選択に役立ちます。

• ループ媒介等温増幅

• LAMP プライマー エクスプローラー
• 種特異的プライマーの設計ツール、MorphoCatcher
• RT-LAMP の Scholia ページ
• SARS-CoV-2を検出するためのRT-LAMPのオープンアクセスプロトコル