制限部位関連DNAマーカー

制限部位関連 DNA (RAD) マーカーは、関連マッピング、 QTL マッピング、集団遺伝学、生態遺伝学、進化遺伝学に有用な遺伝子マーカーの一種です。遺伝子マッピングに RAD マーカーを使用することは、しばしば RAD マッピングと呼ばれます。RAD マーカーとマッピングの重要な側面は、RAD タグを分離するプロセスです。RAD タグは、ゲノム全体にわたって制限酵素の特定の制限部位の各インスタンスのすぐ両側にある DNA 配列です。 ^[1] RAD タグが分離されると、それらを使用して、主に一塩基多型 (SNP)の形で DNA 配列多型を識別し、遺伝子型を判定することができます。^[1] RAD タグを分離して分析することで識別され、遺伝子型が判定される多型は、RAD マーカーと呼ばれます。シーケンシングによる遺伝子型判定は、 RAD-seq 法に似たアプローチですが、いくつかの重要な点で異なります。^{[2] [3] [4]}

各制限部位の周囲の隣接DNA配列の使用は、RADタグの重要な側面です。^[1]ゲノム内のRADタグの密度は、分離プロセス中に使用される制限酵素によって異なります。^[5]遺伝子多型の区別には、異なる制限部位によって引き起こされる断片長多型を使用するRFLPまたは増幅断片長多型（AFLP）などの他の制限部位マーカー技術があります。RADタグ技術における隣接DNA配列の使用は、縮小表現法と呼ばれます。^[2]

RAD タグを分離する最初の手順は、特定の制限酵素で DNA を消化し、ビオチン化アダプターをオーバーハングに連結し、DNA を制限部位間の平均距離よりもはるかに小さい断片にランダムに切断し、ビオチン化断片をストレプトアビジンビーズを使用して分離する ことでした。^{[1]この手順は、当初、}マイクロアレイ解析用に RAD タグを分離するために使用されました。^{[1] [6] [7]最近では、RAD タグ分離手順が}Illuminaプラットフォームのハイスループット シーケンシングで使用できるように変更されており、生のエラー率が大幅に低減し、スループットが高くなるという利点があります。^[5] 新しい手順では、DNAを特定の制限酵素（例：SbfI、NsiIなど）で消化し、P1と呼ばれる最初のアダプターをオーバーハングに連結し、DNAを制限部位間の平均距離よりもはるかに小さい断片にランダムに切断し、切断された末端を平滑末端に準備して2番目のアダプター（P2）を連結し、PCRを使用して両方のアダプターを含む断片を特異的に増幅します。重要なのは、最初のアダプターにMID（分子識別子）と呼ばれる短いDNA配列バーコードが含まれていることです。これは、同じ反応で一緒にプールされ、配列決定された異なるDNAサンプルを識別するためのマーカーとして使用されます。^{[5] [8]} RADタグを分析するためのハイスループットシーケンシングの使用は、RADSeq（RADシーケンシング）などを含む、リプレゼンテーションシーケンシングとして分類できます。^[2]

RADタグが単離されると、それらを使用して、一塩基多型（SNP）などのDNA配列多型を識別し、遺伝子型を判定することができます。^{[1] [5]}これらの多型部位はRADマーカーと呼ばれます。RADタグを見つける最も効率的な方法は、高スループットDNAシーケンシング、^{[5] [8]}によるもので、RADタグシーケンシング、RADシーケンシング、RAD-Seq、またはRADSeqと呼ばれます。

ハイスループットシーケンシング技術が開発される前は、RADマーカーはRADタグをマイクロアレイにハイブリダイズすることによって同定されていました。^{[1] [6] [7]}マイクロアレイの感度が低いため、このアプローチでは、制限部位を破壊してRADタグの欠如につながるDNA配列多型、またはRADタグのハイブリダイゼーションを妨害する実質的なDNA配列多型のいずれかしか検出できません。したがって、マイクロアレイで達成できる遺伝子マーカー密度は、ハイスループットDNAシーケンシングで可能な密度よりもはるかに低くなります。^[9]

RADマーカーは、最初はマイクロアレイを使用して実装され、その後NGS（次世代シーケンシング）に適応されました。^{[9]これは、2006年頃に}オレゴン大学のエリック・ジョンソンとウィリアム・クレスコの研究室によって共同で開発されました。彼らは、 D. melanogasterの組み換えブレークポイントを特定し、イトヨのQTLを検出することで、RADマーカーの有用性を確認しました。^[1]

2012年に、ダブルダイジェストRADseq（ddRADseq）と呼ばれる改良RADタグ付け法が提案されました。^{[10] [11]} 2番目の制限酵素を追加し、ランダムな剪断を置き換え、厳密なDNAサイズ選択ステップを実行することで、低コストの集団遺伝子型判定が可能になります。これは、選択と集団分化または集団適応のための全ゲノムスキャンに特に強力なツールとなり得ます。^[11]

2016年の研究では、ハイブリダイゼーションRAD（hyRAD）^[12]と呼ばれる新しい方法が発表されました。この方法では、ゲノムのランダムな部分をカバーするビオチン化RADフラグメントが、ゲノムショットガンシーケンシングライブラリから相同フラグメントを捕捉するための餌として使用されます。DNAフラグメントは、新鮮なサンプルに適用されたddRADseqプロトコルを使用して最初に生成され、ハイブリダイゼーションキャプチャプローブとして使用されて、目的のフラグメントでショットガンライブラリが強化されます。このシンプルで費用対効果の高いアプローチにより、高度に劣化したDNAサンプルからでも相同遺伝子座のシーケンシングが可能になり、ミュージアムオミクスの分野で新しい研究の道が開かれます。この方法のもう1つの利点は、制限部位の存在に依存しないことで、サンプル間の遺伝子座のカバレッジが向上します。この技術は、最初に旧北区のバッタの一種であるOedaleus decorusの博物館サンプルと新鮮なサンプルでテストされ、その後、リーゼントミツスイ^[13]、節足動物^[14]、その他の種に実装されました。 hyRADを鳥類に導入するための実験プロトコルが開発された。^[15]

• シーケンシングによる遺伝子型判定