細胞透過性ペプチド

細胞透過性ペプチド（CPP ）は、ナノサイズの粒子から小さな化合物、大きなDNA断片まで、さまざまな分子の細胞への取り込みと吸収を促進する短いペプチドです。「カーゴ」は、共有結合による化学結合または非共有結合相互作用によってペプチドと結合します。^[1]

CPP は、研究や医療で使用するために、一般的にはエンドサイトーシスを介して細胞に貨物を送達します。現在の使用は、CPP を介した貨物送達の細胞特異性の欠如と、その取り込みモードの理解不足によって制限されています。開発されている他の送達メカニズムには、CellSqueezeとエレクトロポレーションがあります。^[要出典]

CPP のアミノ酸組成は、リジンやアルギニンなどの正に帯電したアミノ酸が比較的多く含まれるか、極性の帯電アミノ酸と非極性の疎水性アミノ酸が交互に含まれる配列を持つのが一般的です。 ^{[2]これらの 2 種類の構造は、それぞれ}ポリカチオン性または両親媒性と呼ばれます。 CPP の 3 番目のクラスは疎水性ペプチドで、低い正味電荷を持つ非極性残基または細胞への取り込みに重要な疎水性アミノ酸基のみを含みます。^{[3] [4]}

ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）由来のトランス活性化転写因子（TAT）は、最初に発見されたCPPでした。1988年、2つの研究室が独立して、培養中の多数の細胞タイプがTATを周囲の培地から効率的に取り込むことができることを発見しました。^[5]それ以来、既知のCPPの数はかなり増え、より効果的なタンパク質伝達特性を持つ低分子合成類似体が生成されました。^[6]

最近の発見により、ヒトパピローマウイルスなどのパピローマウイルス科はCPPを使用して細胞内膜を貫通し、ウイルスユニットの核への逆行性輸送を引き起こすことがわかりました。^[7]

細胞透過性ペプチドはサイズ、アミノ酸配列、電荷が異なりますが、すべてのCPPは細胞膜を転座し、さまざまな分子貨物を細胞質または細胞小器官に送達する能力を持っています。^[1]転座メカニズムを説明する実際のコンセンサスはありませんが、候補は膜への直接浸透、エンドサイトーシスを介した侵入、および一時的な構造を介した転座の3つのメカニズムに分類できます。CPPの伝達は現在も研究が進められています。^{[8] [9]}

細胞透過性ペプチド（CPP）は、細胞膜を越えてさまざまな種類の貨物分子を輸送することができるため、分子送達媒体として機能します。CPPは、癌やウイルス阻害剤などのさまざまな疾患の治療における薬物送達剤、および細胞標識用の造影剤として、医療において多数の用途があります。後者の例には、 GFP、MRI造影剤、または量子ドットのキャリアとして機能することが含まれます。^[10]

初期の研究の大部分は、ポリカチオン性 CPP の生体膜を介した転座は、エネルギー非依存の細胞プロセスによって起こることを示唆していた。転座は 4 °C で進行し、負に帯電したリン脂質との直接的な静電相互作用を伴う可能性が高いと考えられていた。研究者らは、このエネルギー非依存プロセスの生物物理学的メカニズムを解明しようと、いくつかのモデルを提案した。CPP は純粋な膜システムの生物物理学的特性に直接的な影響を及ぼしますが、蛍光標識プローブ CPP を使用した場合の固定アーティファクトの特定により、CPP インポート メカニズムの再評価が引き起こされた。^[11]これらの研究は、転座経路としてエンドサイトーシスを推進した。直接浸透の例は、TAT に対して提案されている。この提案モデルの最初のステップは、静電相互作用による折り畳まれていない融合タンパク質 (TAT) と膜との相互作用であり、これにより膜が破壊され、融合タンパク質が膜を通過できるようになります。内部移行後、融合タンパク質はシャペロン システムによって再び折り畳まれます。このメカニズムについては合意が得られておらず、クラスリン依存性エンドサイトーシスを伴う他のメカニズムが提案されている。^{[12] [13]}

CPP の取り込みのより詳細な方法が多数提案されており、その中には一時的な細孔形成も含まれています。^{[14] [15] [16] [17] [18]}このメカニズムには、細胞透過性ペプチドと脂質二重層の両側にあるリン酸基との強力な相互作用、一時的な細孔形成の核となる正に帯電したアルギニン側鎖の挿入、続いて細孔表面での拡散による細胞透過性ペプチドの転座が含まれます。このメカニズムは、ペプチド間の協力、大きな正電荷、特にグアニジニウム基などの主要成分が取り込みにどのように寄与するかを説明しています。提案されたメカニズムは、膜の変動の重要性も示しています。実際、一時的な細孔や荷電アミノ酸側鎖の挿入など、膜構造の大きな変動を伴うメカニズムは一般的であり、多くの膜タンパク質機能の中心となる可能性があります。

エンドサイトーシスは、細胞内部化の原因となる 2 番目のメカニズムです。エンドサイトーシスは、細胞膜が内側に折り畳まれて物質を細胞内に取り込む細胞摂取プロセスです。このプロセス中、細胞は細胞膜で吸収することにより、細胞外から物質を吸収します。蛍光またはエンドサイトーシス阻害剤を使用した細胞局在の分類は、ほとんどの検査の基礎となります。ただし、これらのサンプルの準備中に使用される手順により、エンドサイトーシスに関する疑わしい情報が生成されます。さらに、エンドサイトーシスによるペネトラチンの細胞内への侵入は、エネルギー依存プロセスであることが研究で示されています。このプロセスは、エンドサイトーシスを促進するヘパラン硫酸と相互作用するポリアルギニンによって開始されます。研究では、TAT はマクロピノサイトーシスと呼ばれるエンドサイトーシスの形態によって内部化されることが示されています。^{[19] [20]}

研究では、CPPの内部化にはエンドサイトーシスが関与していることが示されていますが、異なるメカニズムが同時に発生する可能性も示唆されています。これは、膜移行とエンドサイトーシスの両方が同時に起こるペネトラチンとトランスポータンの行動によって証明されています。^{[21] [22]}

転座の原因となる3番目のメカニズムは、逆ミセルの形成に基づいています。逆ミセルは、極性基が内部に集中し、親油性基が溶媒中に外側に伸びているコロイド状界面活性剤の凝集体です。このモデルによると、ペネトラチン二量体が負に帯電したリン脂質と結合し、脂質二重層の内部に逆ミセルの形成を生成します。逆ミセルの構造により、ペプチドは親水性環境に留まることができます。^{[23] [24] [25]}ただし、内膜と外膜の間のペネトラチンの分布は非対称であるため、このメカニズムはまだ議論の余地があります。この非対称な分布により、十分に確立されている電場が生成されます。外葉のペプチドの量が増えると、電場が臨界値に達し、電気穿孔のようなイベントが発生する可能性があります。

最後のメカニズムは、内在化は主要な両親媒性ペプチドのファミリーに属するペプチド、MPG および Pep-1 によって起こることを示唆している。円二色性、フーリエ変換赤外分光法、核磁気共鳴分光法からなる物理化学的研究に基づいて、2 つの類似モデルが提案されている。これらのモデルは、空気と水の界面にある単分子膜などのモデル膜を模倣する能力を持つ電気生理学的測定および調査に関連している。提案されている MPG モデルと Pep-1 モデルの主な違いは、細孔を形成する構造である。MPG モデルでは、細孔は β バレル構造によって形成されるが、Pep-1 はヘリックスと関連している。さらに、両方のモデルで強い疎水性リン脂質-ペプチド相互作用が発見されている。^{[26] [27]} 2 つのペプチド モデルでは、キャリア分子の折り畳まれた部分は疎水性ドメインと相関しているが、分子の残りの部分は構造化されていない。^[28]

細胞透過性ペプチドによる転座は、大きな議論の的となっている。転座には複数の異なる経路が利用される可能性があるという証拠が提示されている。さらに、転座のメカニズムは、ペプチドが遊離しているか、貨物に結合しているかによって左右される。遊離したCPPと貨物に結合したCPPの量的な取り込みは大きく異なる可能性があるが、この変化が転座効率の結果なのか、転座経路の違いによるものなのかは研究で証明されていない。結果は、複数のCPPメカニズムが競合しており、複数の経路がCPPの内在化に寄与していることを示している可能性が高い。^[29]

siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイDNA、プラスミドなどの核酸ベースの高分子は、遺伝子発現の制御における有望な生物学的および薬理学的治療薬です。^{[30] [31] [32]}しかし、他の低分子医薬品とは異なり、その開発と応用は高分子量と負電荷によって制限されており、その結果、取り込み効率が低く、細胞内輸送量が少なくなります。これらの問題を克服するために、強力なツールであるCPP核酸コンジュゲートを含むいくつかの異なる送達システムが開発されています。

これまでに提案されているほとんどのCPP-核酸複合体は、共有結合によって形成されています。さまざまなCPP-核酸複合体が、安定な結合または切断可能な結合のいずれかであるさまざまな化学反応によって合成されています。そして、出版物で最も広く使用されている方法は、全段階的固相合成または溶液相または固相フラグメントカップリングによる切断可能なジスルフィド結合です。^[33]安定したアミド、チアゾリジン、オキシム、ヒドラジン結合などの他の戦略も開発されています。^[34] しかし、これらの共有結合法は、CPPと核酸の間の合成共有結合が核酸の生物学的活性を変える可能性があるという懸念によって制限されています。^[35]そのため、MPGやPep-1などの短い両親媒性CPPをキャリアとして使用する化学修飾を必要としない新しい非共有結合戦略が、貨物の送達にうまく適用されています。^{[36] [37]}これらの非共有結合複合体は、静電相互作用または疎水性相互作用によって形成されます。この方法により、核酸やタンパク質などの貨物を、完全な生物学的活性を維持しながら効率的に送達することができます。

短鎖干渉RNA（siRNA）は、特定の疾患遺伝子の発現を妨害し、抑制することができる強力な新しいツールです。^[38] siRNAの細胞内取り込みを改善するために、共有結合または非共有結合のいずれかを介して細胞へのsiRNAの送達を促進するCPP戦略が適用されています。ある研究では、siRNAのセンス鎖の5'末端でジスルフィド結合によりsiRNAがトランスポータンおよびペネトラチンに共有結合され、ルシフェラーゼまたはeGFP mRNAレポーターを標的としています。^[39]別の研究では、siRNAの3'末端の安定したチオマレイミド結合を介してTAT-siRNAコンジュゲートがeGFP遺伝子サイレンシングのためにHeLa細胞に送達されました。^[40]

しかし、より顕著な生物学的反応を伴うsiRNA送達には、非共有結合戦略の方が適しているようです。ある研究では、安定した非共有結合戦略によって形成されたMPG / siRNA複合体は、培養細胞へのsiRNAの導入に成功し、標的mRNAの強力な調節を誘導しました。^{[37]さらに、MPG / siRNA複合体は、遺伝子調節のためにマウスの胚芽細胞へのsiRNAの}生体内送達にも適用されています。^[41] MPGは、分解率の低いsiRNAと安定した複合体を形成し、特定の標的化のために簡単に機能化できるため、共有結合CPP技術と比較した大きな利点があります。

siRNA 細胞送達は、癌疾患、ウイルス感染、遺伝性疾患の治療に有用なツールです。しかし、従来の戦略では、カーゴ分子と CPP を共有結合させるため、体内でsiRNA 分子を効率的に保護できず、文献で報告されている結果に一貫性がありません。最近、非共有結合戦略が成功したことが報告されています。スペーサーとしてリジンと結合した芳香族トリプトファンとアルギニン残基に基づく二次両親媒性ペプチドが、CADY という名前で報告されています。 CADYには20アミノ酸の短いペプチド配列が含まれており、その配列は「Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-システアミド」です。 ^[42] このペプチドは、分子の異なる側に親水性残基と疎水性残基を持つらせん状に自己組織化することができ、最も低いエネルギーを表す2つの異なる表面配向を持ち、1：1から80：1までの異なるモル比でsiRNAと複合体を形成できます。 CADYはsiRNA分子の周りにシールドを形成し、細胞浸透が起こる前に起こる可能性のある生分解プロセスからsiRNAを保護します。 これらのタイプの基質は、生体内で重要な用途を示す可能性があります。

アンチセンスオリゴヌクレオチド（asON）は基礎研究で使用されており、医療治療の可能性として開発されています。CPP戦略は、PNAやPMOなどのアンチセンスオリゴマーを細胞に送達するために開発されました。負に帯電したONの細胞膜による反発と酵素によるasONの分解を克服して、CPPはasONの生物学的利用能を高めます。2種類の中性ON類似体、ペプチド核酸（PNA）とホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（PMOまたはモルホリノ）がこの分野で主流になりつつあります。PNAは、ジスルフィド結合または安定したアミド結合を介してさまざまなCPPと結合されています。^[43]たとえば、21マーPNAをペネトラチンに結合させた場合、ガラニン受容体の発現を阻害する細胞内のアンチセンス活性が観察されました。^[44] HIV-1を標的とするPNAの抗ウイルス活性に関する結果も、TATとのジスルフィド結合を通じて報告されている。^{[45] CPP-PMOコンジュゲートは、SARS [46]}やインフルエンザ^[47]などのいくつかのウイルスの複製を阻害するためにも効果的に使用されており、CPPの結合により、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療薬として開発中のスプライス修飾モルフォリノの有効性が向上した^[48]。

デコイDNAは外因性の二本鎖DNA（dsDNA）であり、特定の転写因子の活性を阻害できるプロモーター配列を模倣することができる。^[49]しかし、dsDNAは他の治療薬と同じ問題を抱えており、バイオアベイラビリティが低い。ある研究では、CPP TPとTP10がNFκBデコイDNAに結合され、インターロイキン1誘導性NFκB活性化とIL-6遺伝子発現の効果が阻害された。^[50]別の研究では、TP10結合MycデコイDNAがN2a細胞の増殖能力を低下させた。^[51]

個々の遺伝子をプラスミド上の特定の部位に挿入することができ、組み換えプラスミドを生細胞に導入することができる。マクロ分岐TATを使用する方法は、さまざまな細胞株へのプラスミドDNAの送達に提案されており、顕著なトランスフェクション能力を示している。^[52] TATの多量体は、ポリ-L-アルギニンまたは変異体TAT2-M1よりも6〜8倍、標準ベクターと比較して390倍、プラスミドDNAのトランスフェクション効率を高めることがわかっている。^[53]

疾患の治療に有益な方法を提示してきた治療用タンパク質の開発は、従来の送達方法の効率の低さによって制限されています。CPP結合タンパク質の細胞質送達の評価はアーティファクトが発生しやすいことがわかっており^[54]、そのため、細胞表面に付着した、またはエンドソームに捕捉されたCPPタンパク質から真の細胞質送達を区別する評価方法を使用する必要があります。^{[55] [56]}最近、CPPを媒体として生物学的に活性な全長タンパク質を生きた細胞や動物に送達する方法がいくつか報告されています。

いくつかのグループがCPP融合タンパク質を試験管内で送達することに成功している。TAT は、ホースラディッシュペルオキシダーゼやRNase Aなどのさまざまなタンパク質を、試験管内でさまざまな細胞株の細胞膜を越えて細胞質に送達することができた。効果的に送達されるタンパク質のサイズ範囲は、30kDaから120-150kDaである。ある研究では、TAT融合タンパク質は、生細胞に対する伝達可能なTAT-Creリコンビナーゼレポーターアッセイを使用して、脂質ラフト依存性マクロピノサイトーシスによって急速に内部移行される。^[57]別の研究では、TAT融合タンパク質が乳がん細胞のミトコンドリアに送達され、乳がん細胞の生存率が低下したことから、TAT融合タンパク質がミトコンドリア機能と細胞生存を調節する能力があることが示された。さらに、環状ポリアルギニンCPPであるcR10は、抗原結合タンパク質を細胞膜を通してエンドサイトーシスに依存しない伝達を可能にし、即時のバイオアベイラビリティを実現した。これにより、研究者らは蛍光抗原結合タンパク質を細胞内に送達し、生細胞の免疫染色を容易にすることができた。^[58]しかし、生体内での研究はほとんど成功していない。ある研究では、TATまたはペネトラチンで架橋されたFab断片を生体内で送達したところ、さまざまな臓器の分布と臓器保持の全体的な増加が見られ、組織局在が示された。^[59]

CPP/タンパク質複合体を形成する非共有結合法も開発されており、共有結合法の限界、例えば架橋前の化学修飾や送達前のタンパク質の変性に対処するものである。ある研究では、短い両親媒性ペプチドキャリアであるPep-1とタンパク質複合体が送達に効果的であることが証明されている。Pep-1は、さまざまなペプチド、タンパク質、さらには全長抗体の迅速な細胞内取り込みを、高い効率と低い毒性で促進できることが示された。このアプローチにより、試薬の配合が大幅に簡素化された。^[60]

CPP は、造影剤を細胞膜を透過させる輸送体として利用されています。これらの造影剤は腫瘍細胞に標識を付けることができるため、がんの診断において重要なツールとなります。また、in vivoおよびin vitro の細胞実験にも使用されています。最も重要な CPP のクラスは、HIV-1 由来の TAT (転写活性化転写)、ペネトラチン、トランスポータンなど、ウイルスから分離されています。最も広く使用されている CPP は、TAT 誘導体に基づいています。TAT はアルギニンを多く含む CPP です。この基質の改良には、非天然の β または γ アミノ酸の使用が含まれます。この戦略には、タンパク質分解 (ペプチド結合がアミノ酸に加水分解される自然分解プロセス) に対する耐性など、複数の利点があります。ペプチド鎖への非天然の酸の挿入には、複数の利点があります。明確な二次構造を持つ安定したフォルダーマーの形成を促進します。^{[61] [62] [63]} β ペプチドは、特に小さな鎖の場合、水溶液中では天然のペプチドよりも構造的に安定しています。二次構造は、シクロヘキサンまたはシクロペンタンフラグメントを含む剛性β-アミノ酸の存在によって強化されます。これらのフラグメントは、より剛性の高い構造を生成し、フォルダマーの開口角度に影響を与えます。これらの特徴は、新しいペプチド設計にとって重要です。らせん状β-ペプチドは、宿主防御ペプチドの抗菌活性を模倣します。^{[64] [65] [66]}この特徴には、らせんの片側にカチオン性-親水性残基、もう片側に疎水性残基の配向が必要です。分子の一方の頭部に蛍光基を付着させると、コントラスト特性が付与されます。CPP の細胞内取り込み能力を高めるための新しい戦略は、リンカーで分離されたポリカチオンドメインとポリアニオンドメインの結合に基づいています。ポリカチオン残基 (ポリアルギニン) と負に帯電した膜細胞との細胞内結合は、ポリアニオン残基 (ポリグルタミン酸) とリンカーの存在によって効果的にブロックされ、これら 2 つの帯電残基間の適切な距離が与えられて、それらの相互作用が最大化されます。これらのペプチドはヘアピン構造をとっており、2 つの荷電部分のプロトン間近接性に対するオーバーハウザー効果相関によって確認されています。この段階では、リンカーのみが生体内アプリケーションでプロテアーゼ加水分解にさらされます。リンカー加水分解が起こり、2 つの荷電フラグメントはより立体配座の自由度が高まります。リンカーがない場合、カチオン性ペプチドは標的細胞とより効率的に相互作用し、タンパク質分解の前に細胞への取り込みが起こります。この戦略は、生体内で腫瘍細胞を標識するのに応用されています。腫瘍細胞は数分でマークされました。リンカーの分解はペプチド鎖に組み込まれたD-アミノ酸（非天然異性体）の量によって予測することができ、これにより生体内でのタンパク質分解は中央のリンカーに制限されます。^{[67] [68] [69] [70]}

量子ドット（QD）は、蛍光基に基づく従来の有機染料よりも優れた光学特性を持つ比較的新しいクラスの蛍光プローブです。QDの主な利点には、高い量子収率、広い吸収スペクトル、サイズ調整可能な発光スペクトル、化学的および光化学的劣化に対する優れた耐性などがあります。生体内試験では、いくつかの正に帯電したペプチド（グアニジン残基に基づく）が細胞膜を通過し、量子ドットなどの付着分子の細胞内取り込みを促進できることが示されています。QDの特性は、それらに結合した有機基質を変更することで簡単に変更できるため、細胞マーカーとして多目的な生物学的ツールを提供します。QDおよびQDバイオコンジュゲートの細胞内送達の方法論の最適化、および長期の生体内光物理的特性の特性評価に関する研究が進行中です。^{[71] [72] [73] [74] [75]}

量子ドットは、亜鉛硫黄 (ZnS) 層で覆われたカドミウムセレン (CdSe) コアに基づくコロイドナノ結晶です。この基板は、CdSe が可視領域で発光し、優れた造影剤であるため、細胞マーカーとして集中的に使用されています。一方、ZnS 層は、コアを酸化から保護し、CdSe が周囲の溶液に浸出するのを防ぎます。この戦略により、発光収率も向上します。特性は、ZnS 保護層の厚さによって調整できます。コロイド QD の発光は、 ZnS、CdS、ZnSe、CdTe、PbSe などのさまざまな種類のコーティング剤を使用することで、 UV-Visから赤外線まで調整できます。量子ドットの特性は、ナノ結晶の特性に影響を与える合成スキーム、高温溶媒/リガンド混合物によっても調整できます。高品質の QD 造影剤は高温で得られます。しかし、水溶性が低いため、細胞マーカーとしての使用は限られており、親水性リガンドによるさらなる機能化が必要である。^{[76] [73]}

QD の利点は、その迅速な作用にあります。QD は数秒で標的組織または細胞に標識を付けることができます。生体内研究では、QD は癌細胞を選択的に標識し、腫瘍部位に蓄積することが示されています。QD で標識された腫瘍細胞は、肺組織に侵入する際に多光子顕微鏡で追跡できます。両方の研究で、スペクトルイメージングと自己蛍光減算により、細胞と組織の多色生体内可視化が可能になりました。QD の主な欠点は、比較的毒性が高いことです。生体親和性を高め、毒性を低下させるさまざまな基質による機能化が進行中です。たとえば、QD シェルの硫黄は、幅広い種類の有機化合物と可逆的なジスルフィド結合を形成できます。^[77]

磁気共鳴画像法（MRI）は、さまざまな金属キレートを使用した、がんの転移や炎症などの疾患診断のための強力なツールです。金属キレートは、近傍の水プロトンの緩和を触媒することで、正常組織と病変組織間のコントラスト信号を増加させます。代表的な例としては、Gd3+低分子量キレートと超常磁性酸化鉄（SPIO）があります。これらの薬剤を体内に投与すると、腫瘍細胞にラベルを付けることができます。または、細胞を造影剤で体外でラベル付けしてから、 MRI技術を使用して体内に注入して監視することもできます。 ^{[78] [79] [80]}

SPIOナノ粒子はMRIで高い感度を付与しますが、細胞に対する親和性が低く、高濃度で作用します。デンドリマーグアニジンを使用したこれらの化合物の機能化は、TATベースのCPPと同様の活性を示しましたが、毒性は高くなりました。ヒドロキシルまたはアミンの周囲を持つデンドロンをベースにした新しい基質は、毒性が低いことが示されています。SPIOの用途には、生体内での細胞標識が含まれます。毒性が低いため、肝臓、脾臓、胃腸の画像化での使用が臨床的に承認されています。 ^[81]

八量体アルギニン残基の存在により、ペプチド、DNA、siRNA、造影剤など、さまざまなカーゴ分子の細胞膜への伝達が可能になる。しかし、膜透過能力は一方向ではなく、アルギニンベースのCPPは細胞膜に出入りすることができ、造影剤の全体的な濃度が低下し、時間の経過とともに磁気共鳴（MR）信号が減少する。これにより、生体内での応用が制限される。この問題を解決するために、金属キレートと伝達部分との間の可逆的な結合であるジスルフィドを含む造影剤は、細胞関連の保持を強化する。ジスルフィド結合は標的細胞環境によって還元され、金属キレートは細胞質に閉じ込められたままになり、標的細胞におけるキレートの保持時間が長くなる。^{[82] [83] [84] [85]}