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ヒトゲノムの大部分は非タンパク質コードDNAで構成されています。[ 1 ]これは、このような配列がタンパク質をコードするために一般的に使用されていないことを示唆しています。しかし、これらの領域はタンパク質をコードしませんが、他の機能を持ち、必要な調節情報を持っています。これらはncRNAのサイズに基づいて分類できます。短い非コードRNAは通常、長さが200 bp未満に分類され、長い非コードRNAは200 bp以上です。[ 2 ]さらに、細胞内での機能によって分類することもできます。インフラストラクチャncRNAと調節ncRNAです。[ 3 ]インフラストラクチャncRNAは翻訳とスプライシングでハウスキーピングの役割を果たしているようで、rRNA、tRNA、snRNAなどの種が含まれます。調節ncRNAは他のRNAの修飾に関与しています。
長鎖ノンコーディングRNA （LncRNA）は、通常、長さが200塩基対以上でタンパク質に翻訳されない転写産物として定義されるRNAの一種です。[4] この制限により、lncRNAは、マイクロRNA（miRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、Piwi相互作用RNA（piRNA）、低分子核小体RNA （snoRNA）、およびその他の短いRNAを含む小型ノンコーディングRNAと区別されます。[ 5 ]長鎖ノンコーディング RNAには、lincRNA、[ 6 ]イントロンncRNA、[ 7 ]環状および線状ncRNAが含まれます。[ 8 ]
長鎖非コードRNA（LincRNA）は、200ヌクレオチドより長いRNA転写産物と定義されます。これらのRNAは、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを持ってはなりません。「遺伝子間」という用語は、タンパク質をコードする遺伝子を含まないゲノム領域からのこれらの転写産物の同定を指します。[ 9 ] LncRNAには、遺伝子近傍にあり、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかであるプロモーターまたはエンハンサー関連RNAも含まれます。[ 9 ]
環状RNA（CircRNA）は、内因性非コードRNAの新しいクラスであり、共有結合で閉じたループ構造を特徴としています。このクラスのncRNAは、5'キャップや3'ポリAテールを持ちません。circRNAは、疾患の診断と治療のための潜在的な分子マーカーとして機能し、ヒト疾患の発症と進行において重要な役割を果たす可能性があると仮説が立てられています。[ 10 ]
小型非コードRNA （sncRNA）はRNAの一種で、通常、長さが200塩基対未満でタンパク質に翻訳されない転写産物として定義されます。 [ 11 ]この制限により、sncRNAはlncRNAと区別されます。このクラスには、マイクロRNA（miRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、Piwi相互作用RNA （piRNA ）、小型核小体RNA （snoRNA）、その他の短いRNAが含まれますが、これらに限定されません。[ 5 ]
マイクロRNA（miRNA）は遺伝子発現の調節において重要な役割を果たします。miRNAの大部分はDNA配列から転写されて一次miRNAになります。これらの一次miRNAはさらに前駆miRNAに処理され、最終的に成熟miRNAになります。ほとんどの場合、miRNAは標的の3'UTR領域と相互作用してmRNAの分解と翻訳抑制を誘導します。[ 12 ] miRNAと5'UTR、コード配列、遺伝子プロモーターなどの他の領域との相互作用も報告されています。特定の条件下では、miRNAは翻訳を活性化したり転写を調節したりすることもできますが、これは効果の位置などの要因に依存します。この相互作用のプロセスは非常に動的で、複数の要因に依存します。[ 13 ] [ 14 ]
リボソームRNA（rRNA）には、rRNA調節において重要な役割を果たす非コードRNAが含まれます。リボソームRNA（rRNA）はタンパク質合成に関与します。RNA分子の中には、RNA酵素（リボザイム）として触媒作用を発揮したり、タンパク質輸送に関与したりするものもあります。最も重要なリボザイムは、リボソームの大きなサブユニットの主要rRNA（真核生物では28S rRNA）です。28S rRNAは、主要な構造的役割を果たすだけでなく、ポリペプチド合成の重要な段階を触媒することも現在では認められています。[ 15 ]
小型核RNA（snRNA）と小型核小体RNA（snoRNA）は、ヌクレオチド修飾とrRNAのプロセシングを誘導することが広く知られています。[ 16 ] [ 17 ] snRNAとsnoRNAはどちらも、核内に存在する小型RNA分子のクラスに分類されます。しかし、その機能は大きく異なります。酵母では、snRNAは80～350ヌクレオチド長であるのに対し、snoRNAは80～1000ヌクレオチド長です。snRNAは、pre-mRNAサイレンシングの調節において重要な役割を果たします。一方、snoRNAは、mRNA編集、rRNAとtRNAの修飾、ゲノムインプリンティングに関与しています。snoRNAの主な機能には、リボソーム形成中のrRNAの成熟が含まれます。小型核RNAと小型核小体RNAは、snRNPとsnoRNPの重要な構成要素であり、それぞれ真核細胞の核内でmRNAとrRNAの成熟に不可欠な役割を果たしている。[ 18 ] snRNAとsnoRNAはどちらも、転写直後のRNAの修飾に関与している。snRNAは、細胞核のスプライシング斑点とカハール体に存在する。snRNAとsnoRNAは、核内の作用部位に輸送されるために、核外輸送用リン酸化アダプター（PHAX）を必要とする。
トランスファーRNA（tRNA）は、メッセンジャーRNA配列をタンパク質に解読するのを助けます。翻訳（コードからタンパク質へのプロセス）中に、リボソーム内の特定の部位で機能します。mRNA分子内には、長さ3ヌクレオチドのコドンがあります。これらのコドンはすべて、特定のアミノ酸を表す固有の普遍的なコードを持っています。tRNAはアダプター分子に分類され、通常76～90ヌクレオチドの長さです。[ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]
1869年にフリードリヒ・ミーシャー博士がサケの精子と膿細胞からDNAを精製したことで、科学者たちは細胞内にタンパク質以外の分子が存在することに気づいた。ミーシャーは膿細胞から分離した非常に酸性の強い分子の存在を特定し、それを「ヌクレイン」と名付けた。この用語は、ミーシャーが分離したDNAがタンパク質ではなく、細胞の核に由来するものであったことから名付けられた。[ 22 ]ミーシャーの発見が再び注目されるようになったのは、1944年にオズワルド・エイブリーがDNAを遺伝情報の担体として提唱した時であった。[ 23 ]
ロザリンド・フランクリンによるX線結晶構造解析と、1953年のワトソンとクリックによるDNA二重らせん構造の解明に続き、DNA構造の理解がさらに深まり、分子生物学の中心教義の確立が可能になった。しかし、中心教義の欠点の1つは、情報の流れがDNAからRNA、そしてタンパク質へと進むという仮定であり、これがさまざまな調節機構の理解を妨げている。[ 24 ]
1955年、ジョージ・パラデは、最初のncRNAを大きなリボ核タンパク質複合体（RNP）の一部として同定した。2番目に発見されたncRNAは、1957年の転移RNA（tRNA）であった。しかし、最初の調節性ncRNAは、1988年に大腸菌から発見されたマイクロRNAであり、micFと名付けられた。[ 25 ]一方、最初の真核生物マイクロRNAは、1993年にC.elegansで発見された。これはlin-4遺伝子に由来し、ステムループ構造を形成する小さなRNA分子（より長いmRNA分子と比較して）として同定された。この構造はさらに修飾され、lin-14転写産物の3'UTR領域に相補的なより短いRNAが生成される。[ 26 ]この経路により、さまざまな翻訳後遺伝子サイレンシング経路の理解が深まった。それ以来、他の多くのmiRNAが発見されている。
この翻訳後サイレンシング経路のメカニズムの詳細な理解は、2001年にトーマス・トゥシュルによって確立されました。二本鎖RNAは、より短い25ヌクレオチド長の断片に処理され、その後、ドロシャ複合体によって短いヘアピン状構造に修飾されることが発見されました。この分子は、ダイサー酵素によって機能的な二本鎖RNA（dsRNA）に切断されます。これらはRISC複合体にロードされ、RISC複合体は細胞質内の目的の標的mRNAを見つけて切断します。[ 27 ]
インプリンティング遺伝子が発見され、ゲノムインプリンティングが確立されたのは1989年のことでした。最初の2つのゲノムインプリンティング遺伝子は、父方から発現するIgf2r [ 28 ]とH19 [ 29 ]でした。これらは両方ともマウスで独立して発見され、7番染色体に局在していました。H19はlncRNAとして機能するものの、スプライシング、3'ポリアデニル化などのpre-mRNAプロセシングと同様の修飾を受け、RNAポリメラーゼIIによって転写されるという点で特異です。このlncRNAはマウスの胚発生において重要な役割を果たし、出生前段階で発現すると致死的になる可能性があります。その後、真核生物ではさらに多くのlncRNAが発見されました。H19の機能間の理解を深めるのに役立った発見の1つは、XIST（X不活性特異的転写産物）と呼ばれるlncRNAでした。[ 30 ]
食品医薬品局（FDA）（1998年）と欧州医薬品庁（EMA）（1999年）によって承認された最初のncRNA治療薬は、フォミビルセンまたはビトラベンと呼ばれています。標的臓器は眼で、免疫不全患者のサイトメガロウイルス（CMV）網膜炎に作用します。[ 31 ]この薬はアンチセンスオリゴヌクレオチドとして機能し、ヒトサイトメガロウイルスの複製を阻害するmRNAの相補配列に結合します。この治療法は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）療法に分類することもできます。[ 32 ] 長年にわたってFDAおよび/またはEMAによって承認されたASO RNA治療薬は多数ありますが、EMAがパチシラン/オンパトロと呼ばれる薬を承認したのは2018年になってからです。[ 33 ]この薬はds-siRNAを作用機序として使用し、遺伝性トランスサイレチンアミロイドーシスに有効であると考えられています。このメカニズムは特にトランスサイレチン（TTR）mRNAを標的としています。RNA治療標的は成熟mRNAに限定されず、成熟のさまざまな段階のmRNAを標的とするために使用されてきました。そのような例の1つがヌシネルセン（スピナラザ）で、ASOとして機能し、運動ニューロン生存2遺伝子（SMN 2）に対応するスプライシング前のpre-mRNAを標的としています。[ 34 ]この薬物療法は、それぞれ2016年と2017年にFDAとEMAによって承認されました。FDAによって承認されたがEMAによって承認されていない薬もあります。これは、2016年にFDAによって承認されたがEMAによって承認されていないエテプリルセン（エクソンディス51）と呼ばれるASOタイプの治療薬の場合に見られます。これは、ジストロフィン（DMD）に対応するpre-mRNAを標的とし、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに対して作用します。[ 35 ] 他にも多くの治療法が開発されており、臨床試験の第I相または第II相段階にある。現在臨床試験中のRNA治療薬は、皮膚（ケロイドなどの疾患の潜在的な治療）から腫瘍（扁平上皮肺癌）まで、さまざまな標的臓器や疾患に及ぶ。
現在まで、FDAとEMAの両方において、ncRNAは化学合成によって製造されるため「単純な」医薬品とみなされています。生物学的に製造されたncRNA（バイオエンジニアリングncRNA製剤：BERAとして知られる）が市場に出回ると、生物学的医薬品のステータスが適用され、法規制に矛盾が生じる可能性があります。[ 36 ]
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）は、特定の標的mRNAと完全に相補的な一本鎖DNA分子であり[ 37 ]、タンパク質翻訳の阻害（立体障害による）、mRNA分解（RNase Hによる切断による）、またはプレmRNAスプライシングの変化によって作用する可能性がある[ 38 ] 。これらの短いオリゴヌクレオチドは、すでにFDAによって10の遺伝性疾患に対して承認されており、現在、多くのものが承認/試験に向けてパイプラインにある。オリゴヌクレオチド技術を使用することで、 RNA干渉を介してタンパク質発現を制御できるようになり、これまで「薬剤不可能」とされていたタンパク質に影響を与えることができるようになった。この治療法には多くの有望性と可能性が秘められているが、多くの制限も伴う[ 38 ] 。
siRNAやマイクロRNAと比較して、ASOはタンパク質発現の抑制においてより汎用性が高く、標的翻訳を促進する能力も備えています。ASOは容易かつ正確にカスタマイズできるため、事実上あらゆる変異遺伝子を標的にすることができます。これにより、精密医療や個別化医療の分野での応用レベルが向上します。[ 38 ] 特定の組織へのASO療法の主な課題と細胞への取り込みは、大きな課題と制限をもたらします。リポソーム送達は、このような問題を克服する一つの方法です。リポソーム送達システムにも独自の制限があります。血流中の血清タンパク質はリポタンパク質を不安定化させます。この不安定化によりタンパク質が枯渇し、積荷が不安定な環境に晒されます。この障害は、PEG（ポリエチレングリコール）を使用することで克服できます。しかし、PEGは生分解性ではないため、体内に蓄積し、副作用や過敏症を引き起こします。さらに、PEGによる複数回の治療は、PEG抗体の形成につながり、それが結合しているリポソームの破裂を防ぐ効率の低下につながる可能性があります。[ 38 ] 免疫リポソームを使用すると、その領域で発現するタンパク質に特異的な抗体を使用することで、ASO薬が標的部位に直接作用し、他の場所には作用しないため、標的化がより特異的になることが示されています。さらに、免疫リポソームは解離が遅いため、カプセル化されたASO薬を正確に放出することができます。[ 38 ] [ 39 ]
長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）は、mRNAと同様の合成機構を持つものの、mRNAとは異なりタンパク質に翻訳されない、200ヌクレオチド以上の長さを持つ大きな転写産物です。lncRNAは、相互作用要素と構造要素から構成されています。相互作用要素は他の核酸やタンパク質と直接相互作用し、構造要素は一部のlncRNAが二次構造や三次構造を形成する能力を示します。lncRNAは、相互作用要素を用いて核酸と相互作用し、二次構造を用いてタンパク質と相互作用する能力を持つため、miRNA（マイクロRNA）などの他のノンコーディングRNAよりも多様な機能を発揮します。lncRNAは、遺伝子の特定領域が転写要素や様々なエピジェネティック修飾に結合する能力に影響を与えることで、遺伝子調節において重要な役割を果たすことが確立されています。その一例として、X染色体不活性特異的転写産物（XIST）が挙げられます。ヒトでは、46,XX の女性は 46,XY の男性に比べて余分な X 染色体 (155Mb の DNA) を持っています。この遺伝子量の不均衡を解消するため、ヒトの女性では胚発生の 2～8 細胞期頃に、一方の X 染色体がランダムに不活性化されます。この不活性化は、最初のサイレンシングとそれに続く不活性化 X 染色体 (Xi) の維持の両方においてエピジェネティックな寄与があるため、細胞分裂を通して非常に安定しています。この不活性化は、lncRNA である XIST によって行われます。XIST はシスで生成され、生成された X 染色体を不活性化します。不活性化された X 染色体は、「バール小体」と呼ばれる凝縮したヘテロクロマチン構造として観察されます。[ 40 ] 2013年の研究では、XISTのこの能力をトリソミー21の治療に対する潜在的な治療アプローチとして利用しました。[ 41 ]トリソミー21はダウン症候群としてよく知られており、21番染色体の余分なコピーの存在によって引き起こされます。この研究は、XIST遺伝子のサイズが大きいため、他の研究では染色体に組み込むことができなかったため、他に類を見ないものでした。この研究では、ダウン症候群の患者から採取した細胞の21番染色体の1つにXISTを組み込みました。この研究では、凝縮したヘテロクロマチンの形で21番染色体の1つが不活性化されることを観察し、それを21番染色体バール小体と名付けました。このような実験は、lncRNAベースの治療法が臨床試験段階にないにもかかわらず、実験室環境の細胞で機能することが示されています。このような研究の意義は、トリソミー21やその他の染色体異常を将来の遺伝子治療研究の対象領域に持ち込む可能性があります。[ 41 ]
ncRNA療法を妨げる主要な問題の一つは、一本鎖RNA分子の安定性である。RNAは通常一本鎖であるため、dsDNA分子に比べてやや不安定である。しかし、これは一本鎖RNAを二本鎖RNA（dsRNA）に加工することで克服できる。dsRNAは室温でより安定しており、保存期間が長いため、これは非常に効果的である。2番目の主要な問題は、RNA分子の細胞/組織/臓器特異的なターゲティングである。一般的に、これはdsRNAを脂質ナノ粒子に封入し、それをリガンドとして標的細胞表面の受容体に結合することで克服される。脂質粒子は、その特異的な受容体を介して肝細胞に取り込まれ、このメカニズムは肝細胞/癌のターゲティングに効果的であると思われる。[ 42 ] 比較的容易な送達メカニズムを持つもう1つの臓器は眼である。これには、目的のncRNAを眼に直接直接注入する侵襲的な技術が必要である。これらの技術は侵襲的であるだけでなく、標的臓器のすべての細胞が目的の ncRNA によって標的とされているかどうかも保証されません。RNA 分子が細胞に入ると、さらに問題が発生します。その 1 つは免疫系です。私たちの免疫系は、細胞内病原体関連分子パターン (PAMP) 受容体と細胞外トール様受容体 (TLR) を使用して RNA を認識できます。受容体の活性化は、サイトカイン (IFNy - インターフェロン ガンマ) を介した免疫応答につながります。免疫応答を克服するための一般的な応用には、第 2 世代の化学修飾が含まれます。このプロセスには、免疫応答を回避するために一度に 1 つの小さな化学修飾を導入することが含まれます。しかし、このような修飾試薬を使用した臨床試験で有害な免疫応答が報告されています。[ 43 ]免疫原性と ncRNA 療法の問題に対する決まった答えはありません。ncRNA 送達メカニズムとして、多くの臨床試験で修飾アデノウイルスベクターが広く使用されています。[ 44 ]特に、アデノウイルスベクターは、生細胞内での安定性と非病原性のため、効率的な送達システムと考えられています。[ 45 ]ウイルス形質導入は基礎研究において大きな成果を上げていますが、非特異的であるため、標的以外の細胞への形質導入が問題となっています。今後の試験や臨床試験に向けて、ウイルス形質導入の精度を向上させるためのさらなる研究が必要です。
2021年12月、FDAはASO医薬品の使用に関するガイダンス案を発表しました。このガイダンス案は、重度の衰弱性疾患または生命を脅かす疾患に対する個別化治験用アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）医薬品を開発している治験依頼者・研究者を対象としています。重度の衰弱性とは、重大な不可逆的罹患を引き起こす疾患または状態を指します。一方、生命を脅かすとは、治療によって生存という終点に至らない限り、死亡する可能性が高い疾患または状態を指します。通常、重度の衰弱性で生命を脅かす疾患を抱える患者には代替治療の選択肢がなく、治療を受けなければ疾患は急速に進行し、短期間のうちに早期死亡や壊滅的または不可逆的な罹患につながります。
医薬品開発は通常、多数の個人を対象としていますが、ASOの作用機序の特異性と治療可能な患者集団の希少性から、この場合はそれが不可能です。FDAの規制では、個々のASO製品をヒトに投与するプロトコルは、ヒトに投与する前に治験審査委員会（IRB）による審査と承認を受ける必要があります。対象者が小児の場合は、その小児の生命に影響を与える可能性のある発達上の問題の発生を防ぐために、追加の安全対策を特定する必要があります。治験依頼者は、対象者本人またはその責任者からインフォームドコンセントを得る必要があります。同意書には、ASO薬の使用に伴う合理的に予見可能なリスクや不快感の説明を含める必要があります。また、治験依頼者は、ASOが有益であることを確認するために、対象者の臨床診断と遺伝子診断を取得する必要があります。分析は、遺伝子配列決定、酵素分析、生化学検査、画像評価によって行うことができます。すべての結果を申請書に含める必要があります。また、スポンサーは、ASO薬の標的となる遺伝子変異の役割を立証する証拠を提出する必要がある。スポンサー／治験責任医師は、特定された遺伝子変異が当該個人に固有のものであることを示す証拠も提出する必要がある。
このガイドラインでは、開始用量はモデル生物またはin vitro試験から収集された入手可能な非臨床データに基づいて決定し、入手可能な他のASO製剤の投与量情報と相関させるべきであると示唆しています。開始用量では薬理作用が期待されます。さらに、用量漸増法を用いることが推奨されます。これには、薬力学的効果および/または治験参加者のASOに対する反応に基づいて、初期用量から用量を漸増するステップが含まれます。
さらに、FDAに提出されるプロトコルには、明確な投与計画と、個々の患者に対する薬剤の臨床薬力学的効果に基づいて開始用量、投与間隔、および用量増加または用量減少の計画を選択するための正当性が必要です。また、FDAに提出される薬剤計画には、予想されるすべての結果を含める必要があります。用量増加中は、研究者が患者を綿密に監視することが非常に重要です。増加期間中は、治療効果を確認するために十分な時間を確保する必要があります。研究者は、正当な理由なしに投与量とともに投与間隔を同時に変更しないことが推奨されます。提出される計画には、毒性が観察された場合の減量/中止計画を含める必要があります。薬剤の副作用を把握するためだけに、すべての薬剤投与は入院環境で行われる必要があります。薬剤の毒性、有益性、および副作用が特定されたら、同じ濃度の薬剤が投与される限り、外来で薬剤を投与することができます。[ 46 ]