ナノスケール二次イオン質量分析

NanoSIMS（ナノスケール二次イオン質量分析）は、 CAMECA社が製造した二次イオン質量分析の原理で動作する分析機器です。^[1] NanoSIMSは、サンプルの元素および同位体組成のナノスケール分解能測定値^[2]を取得するために使用されます。NanoSIMSは、元素または同位体分布のナノスケールマップの作成、最大7つの質量の並列取得、同位体識別、高質量分解能、サブppmの感度、最小50nmの空間分解能を実現できます。^[3]

NanoSIMS装置のオリジナル設計は、フランスのパリ南大学とフランス国立航空宇宙研究院のジョルジュ・スロジアンによって考案されました。^[3]現在、世界中に約50台のNanoSIMS装置があります。^[4]

NanoSIMS はイオン源を使用して一次イオンビームを生成します。これらの一次イオンはサンプル表面を侵食して原子衝突を引き起こし、これらの衝突の一部は二次イオン粒子の放出をもたらします。これらのイオンは質量分析計を通過し、質量が測定され、識別されます。^[5]一次イオンビームはサンプル表面全体にラスター化され、各ピクセルから発生したイオンの数を最高 50 ナノメートル (nm) の解像度でカウントすることで、元素と同位体の分布の「マップ」が作成されます。これは、従来の SIMS の 10 ～ 50 倍の解像度です。^{[6] [7]}これは、共軸レンズアセンブリを使用して一次プローブをサンプルの近くに配置することで実現されます。^[7]一次イオンビームはサンプル表面に 90° で衝突し、二次イオンは同じレンズアセンブリを介して抽出されます。これにより、個々の細胞の同位体組成を 100 万分の 1 (ppm) または 10 億分の 1 (ppb) の範囲で区別できます。この設定の主な欠点は、一次イオンビームと二次イオンビームの極性が逆でなければならないため、同時に検出できる元素が制限される可能性があることです。

NanoSIMS は、イオン間の微小な質量差を M/dM > 5000 の分解能で検出できます。ここで、M は同位体の公称質量、dM は対象の同位体間の質量差です。^[8] NanoSIMS の高質量分解能機能により、質量が非常に近い場合でも、サンプル内の異なる元素とその同位体を識別し、空間的にマッピングできます。質量分析計はマルチコレクションが可能で、水素からウランまで、最大 5 (NanoSIMS 50) または 7 (NanoSIMS 50 L) の質量を同時に検出できますが、制限があります。^{[5] [7]}質量の数が比較的多いため、実行間で発生する可能性のある機器またはサンプルの状態の変化が回避され、測定エラーが排除されます。^[8]

イオンビームは、負イオンまたは正イオンを検出するように設定する必要があります。通常は、それぞれセシウム+ビームまたは酸素-ビームを使用して完了します。^[9]達成可能な高質量分解能は、特に生物学的アプリケーションに関連しています。たとえば、窒素は生物で最も一般的な元素の1つです。ただし、窒素原子の電子親和力が低いため、二次イオンの生成はまれです。代わりに、CNなどの分子を生成して測定できます。ただし、同位体の組み合わせ、たとえば同重体 ¹³ C ¹⁴ N-、および¹² C ^{15 N-により、それぞれ}27.000ダルトンと27.006ダルトンのほぼ同じ分子量が生成されます。13 C ¹⁴ Nと¹² C ¹⁵ Nは質量がほぼ同じであるため個別に測定できない他のイメージング技術とは異なり、NanoSIMSではこれらの分子の違いを安全に区別できるため、同位体スパイク実験を行うことができます。^[9]

磁場型質量分析計は、異なる質量電荷比のイオンを物理的に分離します。二次イオンの物理的分離は、イオンが二次イオンの速度ベクトルに垂直な磁場を通過するときにローレンツ力によって発生します。ローレンツ力とは、粒子が力を受けることを意味します 。

${\displaystyle \mathbf {F} =q\left[\mathbf {E} +(\mathbf {v} \times \mathbf {B} )\right]}$

イオンが電荷q を維持し、速度vで電場Eと磁場Bを移動するとき、二次イオンはサンプルの表面から放出され、通常は数電子ボルト(eV) の運動エネルギーを持ちますが、数 keV のエネルギーを持つものもかなり少数存在します。静電場がサンプル表面から放出された二次イオンを捕捉し、抽出されたこれらのイオンは質量分析計に送られます。正確な同位体測定を行うには、高透過率と高質量分解能が必要です。高透過率はサンプル表面と検出器の間での二次イオンの損失が少ないことを意味し、高質量分解能は二次イオン (または対象分子) を他のイオンや同様の質量のイオンから効率的に分離できることを意味します。一次イオンは、単位表面積あたり特定の周波数で表面に衝突します。衝突によってサンプル表面から原子が飛び出し、これらの原子のうちごく少量だけがイオン化されます。これらは二次イオンとなり、質量分析計を通過して検出されます。各一次イオンは、同位体の二次イオンを多数生成し、検出器に到達してカウントされます。カウント率は次のように決定されます 。

${\displaystyle I(^{i}M)=d_{\mathrm {b} }\times S\times Y\times X_{\mathrm {M} }\times A_{\mathrm {i} }\times Y_{\mathrm {i} }\times T}$

ここで、I ( ⁱ M) は元素Mの同位体ⁱ Mの計数率である。同位体の計数率は、濃度X _Mと元素の同位体存在比A _iに依存する。一次イオンビームは、スパッタされる二次イオンYを決定するため、単位表面積あたりの 1 秒あたりのイオン量として定義される一次イオンビームの密度d _bは、一次イオンが均等に分布するサンプルの表面積Sの一部に影響する。スパッタされた二次イオンのうち、イオン化されるのはY _iの一部だけである。イオンが質量分析計から検出器に正常に転送される確率はTである。Y _iとTの積は、イオン化され検出される同位体の量を決定するため、有効収量と見なされる。^[10]

サンプルの準備は、NanoSIMS分析、特に生物学的サンプルの分析において最も重要なステップの1つです。^[11]サンプルの構造だけでなく、サンプル内の分子の真の空間分布と存在量を最大限に維持するために、個々の実験ごとに特定のプロトコルを開発する必要があります。 NanoSIMSは超高真空下で動作するため、サンプルは真空対応（揮発性物質を含まない）、平坦（イオン化軌道の変化を低減）、導電性（ Au、Pt、またはCによるスパッタコーティングによって実現可能）でなければなりません。 細胞や組織などの生物学的サンプルは、化学固定または凍結固定で準備し、樹脂に包埋してから薄いスライス（100 nm - 1μm）に切断し、分析のためにシリコンウェーハまたはスライドに置くことができます。^[11]金属組織サンプルのサンプル準備は一般にはるかに簡単ですが、平らで傷のない表面を実現するには非常に優れた金属組織研磨が必要です。 ^[4]

NanoSIMSは、地質学、材料科学、生物学的サンプルからサブミクロン領域、粒子、または介在物の同位体および元素測定の空間的変動を捉えることができます。^[12]この装置は、エネルギー生成と貯蔵の候補としてますます重要になっている複雑な組成を持つ ナノ構造材料を特徴付けることができます。

NanoSIMS は宇宙化学の問題の研究にも有効であることが証明されており、隕石から採取した単一、マイクロまたはサブマイクロメートルサイズの粒子のサンプルや、集束イオンビーム(FIB) 技術で作成したミクロトーム切片を分析できます。ミクロトーム切片または FIB 切片を使用する場合、NanoSIMS は透過型電子顕微鏡(TEM)と組み合わせることができます。この組み合わせにより、サブマイクロメートル スケールで 相関性のある鉱物学および同位体の現地研究が可能になります。

高感度で高質量分解能を実現し、微量元素の画像化と定量化を可能にするため、材料研究に特に有用である。^[13]

ナノSIMSはもともと地球化学や関連研究のために開発されたが、現在では生物学や微生物学を含む幅広い分野で利用されている。生物医学研究では、^[2]ナノSIMSは多同位体イメージング質量分析法（MIMS）とも呼ばれる。^[14] 50 nmの解像度により、細胞および細胞内の特徴をこれまでにない解像度で分析できる（参考までに、モデル生物である大腸菌の直径は通常1,000～2,000 nm）。この高解像度により、さまざまな安定同位体を含む分子の細胞内蓄積とフラックスを測定できる。^[15]ナノSIMSは、純粋培養、共培養、混合コミュニティサンプルに使用できる。^[8]

生物学におけるNanoSIMSの最初の使用は、2004年にペーターランデルとレシェンによって行われました。彼らはNanoSIMSのプロトタイプを使用して、真核細胞の炭素と窒素の同位体を検査および測定しました。この研究は、生物サンプルの細胞内スケールで炭素と窒素の同位体比を直接測定した初めての研究でした。^[16]

有機金属薬剤用の NanoSIMS の開発は、細胞内レベルでの生物活性分子の分布を調べる道を開いた。Legin ら^[17]は NanoSIMS と蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡を組み合わせて、ヒト大腸がん細胞における¹⁵ N 同位体標識 Pt 含有シスプラチンの細胞内分布を特徴付けた。シスプラチンは大腸がん細胞の標的核に現れた。¹⁵ N と Pt が分離されていることから、細胞内代謝が作用経路にあることが示された。マクロファージのリソソームへのアミオダロンの内在化は Jiang ら^[18]に図示されている。検出限界が低いため、アミオダロン分子中の¹²⁷ I の 2 つのヨウ素原子により、NanoSIMS によるラベルフリーのイメージングが可能になった。ヨウ素とリンのイメージングに加え、 127 I の強度を 31 P に対してプロットすると^、ヨウ素^とリン脂質^の量の間に直線関係があることが示された。これらの結果は、アミオダロン誘発性リン脂質症の証拠を明らかにしています。

Heら^[19]は、 NanoSIMSデータと後方散乱電子顕微鏡法を組み合わせて、臭素で標識された治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド（Br-ASO）のいくつかの種類の培養細胞と重要なマウス組織（心臓、腎臓、肝臓）の分布を可視化しました。彼らは、ホスホロチオエートASOが糸状仮足と細胞の内核膜に関連することを実証しました。彼らはまた、マウス組織におけるASO分布の重要な細胞内および細胞内不均一性を記録しました。Becquartら^{[20]は、ヒト肝細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド治療薬の絶対濃度を報告しています。彼らの方法は、プロドラッグ13C}標識L-ドーパ の絶対濃度を報告したThomenら^{[21]の研究に基づいています。}

NanoSIMSは、材料科学のさまざまな分野で使用されています。^[4]ナノSIMSは、金属の水素脆化の研究に重要な微細構造的に関連するスケールで水素と重水素をマッピングすることができますが、水素と重水素を正確に検出することには大きな課題があります。^{[22 ]}

NanoSIMSと並行して使用される他の顕微鏡技術は、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）^[24]による分類情報や、透過型電子顕微鏡（TEM）や走査型電子顕微鏡（SEM）による追加の生理学的または微細構造的特徴の特定など、複数の種類の情報を取得することを可能にする。

免疫金標識など、細胞の細胞内特性を標識して特定するために使用される従来の方法も、NanoSIMS 分析で使用できます。免疫金標識では、抗体を使用して特定のタンパク質を標的とし、その後、抗体を金ナノ粒子で標識します。NanoSIMS 機器は金粒子を検出し、標識されたタンパク質の位置を高解像度で提供します。抗がん剤として使用される金含有化合物または白金含有化合物は、NanoSIMS を使用して画像化され、それぞれ乳がん細胞と大腸がん細胞の細胞内分布を調べました。^[25] 別の研究では、抗体に蛍光ラベルを追加することなく抗体と抗原の結合を研究し、ラベルフリーの局在と高解像度での定量分析を可能にしました。^[26]

NanoSIMS分析で一般的に使用されるもう1つの一般的な手法は、安定同位体プローブ法です。この方法では、安定同位体標識された生物学的に関連のある化合物を生物に導入し、消費および有機物への統合を行います。NanoSIMSで分析する場合、この手法はnanoSIPと呼ばれます。^[27] NanoSIMSを使用すると、どの生物がどの分子を取り込んだか、標識分子が半定量的に組み込まれた量、および細胞のどこで組み込みが発生したかを検出できます。安定同位体標識分子のNanoSIMSよりも解像度の低い以前の定量分析手法は、分析されたバルク材料に限定されており、個々の細胞または細胞内コンパートメントの寄与に関する洞察を得ることができませんでした。^[28]さらに、実験セットアップから大きな外来分子（抗体や金粒子など）を除去することで、他の顕微鏡技術に必要な標識分子が通常とは異なる生化学的応答または特性を持つ可能性があるという懸念が軽減されます。

この技術は栄養素の交換を研究するのに使用できます。マウスの腸内微生物叢を調査し、どの微生物が宿主由来の化合物を摂取しているかを調べました。このため、マウスには安定同位体標識アミノ酸を豊富に含む餌を与え、微生物バイオマスを調べました。^[29] NanoSIMSを使用すると、個々の微生物の代謝への寄与を調べることができます。NanoSIMSは、堆積物サンプルに^15Nの窒素含有化合物を供給することで、深海の細菌と古細菌の窒素固定能力を研究し、初めて証明するために使用されました。^[30] NanoSIMSは、細胞内に蓄積された炭素やその他の基質の量から、生成されるバイオマスの量を推定できるため、生物の成長率を推定するためにも使用できます。^[31]

有機物は、環境中ではさまざまな比率で安定同位体を自然に含んでいるため、生物の食物源の起源に関する情報を得ることができます。食物源の有機物の種類によって安定同位体の量が異なり、それがこれらの食物源を食べる生物の組成に反映されます。^[32]このタイプの分析は、嫌気性メタン酸化古細菌と硫酸還元細菌の共生関係を調べるために、2001年にFISHと組み合わせて初めて使用されました。^[33]この方法では、自然に存在量が少ない同位体は検出できない場合があります。

ナノSIMSは、岩石記録に保存されている微粒子の元素および同位体組成を調べるのにも使用できます。^[6]元素の種類と同位体比は、物質が生物起源かどうかを判断するのに役立ちます。^[8]ナノSIMSは、2005年にロバートらによってこの古生物学の分野で初めて使用されました。^[34]この研究では、微化石に細胞壁を思わせる「球状」に配置された炭素、窒素、硫黄元素が含まれていることがわかりました。測定された炭素と窒素の比率も生物起源の指標として機能しました。化石の周囲の岩石は炭素と窒素の比率が非常に異なっていたためです。^[6]