ミトプラスト

ミトプラストとは、外膜が除去され、内膜とマトリックスがそのまま残ったミトコンドリアのことである。^{[ 1 ]}

このプロセスを開始するには、まず培養細胞からミトコンドリアを分離する必要があります。これは通常、ホモジナイゼーションによって細胞内物質を放出し、分画遠心分離によってミトコンドリアを他の細胞小器官から分離する2段階のプロセスです。ミトコンドリアが分離されたら、ミトプラストを形成できます。ミトプラストは、フレンチプレスと呼ばれる装置を使用して形成されるのが一般的です。ミトコンドリアがフレンチプレスの狭いバルブを通過する際に、約2,000 psiという非常に高い圧力がかかり、ミトコンドリアの外膜が破裂します。ミトプラストは沈殿し、使用するまで特定の保存バッファーに保存されます。ミトプラストが必要になったら、ミトコンドリアマトリックスを膨張させる塩化カリウム（KCl）インキュベーションバッファーに入れるだけです。膨張の結果、内膜が外膜から突き出て、2つの異なる形状のいずれかを形成します。^{[ 2 ]}フレンチプレス法で生成されたミトプラストは通常​​、二葉の小胞を形成し、8 字型に似た形をしています。^{[ 3 ]}この 8 字型のミトプラストは最も健康であると考えられているため好まれています。しかし、O 字型のミトプラストも形成されることがありますが、このタイプは損傷していることが多いため、実験用には好まれません。

電子顕微鏡の発達により、1930年代以降、ミトコンドリアに関する科学的理解は飛躍的に進歩した。1950年代初頭には、ミトコンドリアには2つの異なる膜が存在することが科学者によって明らかにされた。しかし、ミトコンドリアの研究は主に電子伝達系と酸化的リン酸化に焦点を当てていたため、2つのミトコンドリア膜を分離する方法が開発されるまでには、それから10年以上を要した。

1960年代半ばから後半にかけて、いくつかの独立した研究室が、ミトコンドリア外膜とミトコンドリア内膜の分離に成功したと主張した。1967年3月、フランスの栄養生理学研究所の研究チームは、ミトコンドリア外膜の酵素活性に関する研究について論じた論文を発表した。彼らの研究ではミトコンドリア外膜の分離が必要であったため、 2つのミトコンドリア膜を分離するためにジギトニンと超音波処理を連続的に用いる方法も記述された。分離手順を完了するために、外膜の粗画分は分画遠心分離によって精製された。^{[ 4 ]}約1年後の1968年7月、ジョンズ・ホプキンス大学医学部の生理化学科の研究チームは、ラット肝臓のミトコンドリア膜を分離するためにジギトニンと分画遠心分離を用いる方法を記述した論文を発表した。外膜と内膜を分離することに加えて、ルブロールと呼ばれる非イオン性界面活性剤で処理することにより、内膜とマトリックスをさらに分離することができました。このプロセスにより、各ミトコンドリア成分内の相対的なタンパク質含有量を計算することができました。^{[ 5 ]}両方の論文で、低濃度のジギトニンを使用して外ミトコンドリア膜を分離する根拠は、外膜がコレステロールに富んでおり、ジギトニンと結合するからでした。さらなる研究の後、ジョンズ・ホプキンス大学の研究チームは、外膜がなく、内膜とマトリックスが比較的無傷のミトコンドリアを生成するために、ミトプラスト調製法を改良することができました。

2つの研究グループによって記述された別のミトプラスト調製法は、肝ミトコンドリアを膨張・収縮サイクルにさらした後の内膜の選択的収縮を利用した。この手順では、膨張した外膜は自然に、または理想的には穏やかな超音波処理を受けた後に破裂した。外膜の破裂後、内膜成分は分画遠心分離によって外膜から分離できた。^{[ 6 ]}この手順は、外膜と内膜の明確な違い、特に浸透挙動と透過性に関する違いにより効果的である。広範な研究によると、内膜は展開と再折り畳みによって浸透圧の変化に応答することができる。しかし、外膜は浸透圧の変化に対して可逆的な応答を示さない。したがって、外膜の膨張と破裂は、浸透圧の変化による内膜の展開によって引き起こされる受動的なプロセスである。

これらの分離方法は当時としてはかなり効率的であることが証明されていたものの、フレンチプレスなどの新しい技術が開発され、研究者にとってミトプラストの作成がより迅速かつ容易になったことで、その機械的な性質は時代遅れとなった。

研究者がミトコンドリアの2つの膜を分離してミトプラストを形成できるようになったことで、ミトコンドリア研究に多くの新たな可能性が開かれました。前述のように、研究者はミトコンドリアの各構成要素におけるタンパク質の相対的な含有量を計算できるようになりました。さらに、ミトプラストによって、内膜が外膜に覆われているためこれまで不可能だったミトコンドリア内の酵素分布を解明することが可能になりました。そのため、ミトプラストが容易に作製できるようになってから間もなく、ミトコンドリアに存在すると考えられていたほぼすべての酵素に関する様々なデータが入手可能になりました。

ミトプラストは、ミトコンドリアが外膜を除去した後でも正常な機能を維持できるため、ミトコンドリア機能の電気生理学的解析にも有用です。特に、パッチクランプ電気生理学は、内膜の機能性を研究するための新しい方法として登場しました。^{[ 7 ]}この方法は、膜を横切る高感度な電流測定を可能にし、電子伝達系やプロトンリーク（すなわち、電気化学的勾配に沿ったプロトンの移動とATP合成酵素によるATP合成の分離）の研究に役立ちます。