リムルスアメーバ細胞溶解物

カブトガニ血球溶解液（LAL ）は、大西洋カブトガニ（Limulus polyphemus ）の運動性 血液細胞（血球）の水抽出物です。LALは、グラム陰性細菌の細胞膜の最外膜である細菌莢膜の成分であるリポ多糖類（LPS）などの細菌エンドトキシンと反応します。この反応は、細菌エンドトキシンの検出と定量に広く使用されているLAL試験の基礎となっています。

アジアでは、地元のカブトガニTachypleus gigasまたはTachypleus tridentatusに基づく同様のTachypleus amebocyte lysate（TAL ）テストが代わりに使用されることがあります。^[1]組換え因子C（rFC）アッセイは、同様の反応に基づくLALとTALの代替です。^[2]

アメリカの医学研究者フレッド・バングは1956年に、グラム陰性細菌はたとえ殺されたとしても、カブトガニの血液をゲル、つまり一種の半固体の塊に変えるだろうと報告した。後に、この動物の血液細胞、アメーバサイトと呼ばれる可動細胞には、凝固因子であるコアギュロゲンを含む顆粒が含まれていることが認識された。これは、細菌のエンドトキシンに遭遇すると細胞外に放出される。凝固とそれに続くゲル化の後、結果として生じるゲルには、動物の半閉鎖循環系の細菌感染が含まれていると考えられる。^[3]溶解物の現代的な分析により、複数の酵素が順番に働いてゲルを生成するこのカスケードのシステムが理解されるようになった。エンドトキシン誘発性凝固の入り口は、リムルス凝固因子Cである。^[4]

1977年、米国食品医薬品局（FDA）は血液と接触する薬品、製品、機器の検査にLALを承認した。それ以前は、この目的でウサギを使ったはるかに時間がかかり、費用のかかる検査が使用されていた。^[5]

カブトガニは集められ、心膜から血液が抜かれる。その後、一部のカニは水に戻され、他のカニは食用または餌として販売される。カブトガニからLALを抽出している企業は、2008年以前には死亡率は3%以下であると述べていた。^[6] 2009年のマサチューセッツ州海洋漁業局の研究では、以前の研究ではオスの死亡率は5～15%、メスの死亡率は29%と推定されている。研究自体では、すぐに水に戻されたメスの死亡率は22%、商業的慣行を反映するために一晩放置されたメスの死亡率は30%であることが判明した。^[7]遠心分離機を使用して血球を血清から分離し、次に蒸留水に入れて膨張させて破裂させる（「溶解」）。これにより細胞内部から化学物質が放出され（「溶解物」）、これを精製して凍結乾燥する。サンプル中のエンドトキシンを検査するには、サンプルを溶解物と水と混合します。凝固が起こるとエンドトキシンが存在します。^[8]

基本的な方法論は3つあります。ゲル凝固法、比濁法、発色法です。LALの主な用途は、血液や脳脊髄液に接触する非経口医薬品や医療機器の試験です。米国では、FDAがそのような製品のエンドトキシン試験としてLAL試験の検証ガイドラインを発行しています。^[9]

LALカスケードは、別の因子Gを介して（1,3）-β-D-グルカンによっても誘発される。細菌性エンドトキシンと（1,3）-β-D-グルカンは、病原体関連分子パターン（PAMP）と呼ばれ、哺乳類で炎症反応を引き起こす物質であると考えられている。^[10]

LAL を使用したエンドトキシン試験で最も時間のかかる点の 1 つは、LAL 試験を妨害してエンドトキシンの回収率に影響する可能性のあるアッセイ阻害を克服するためにサンプルを前処理することです。試験対象の製品がエンドトキシン回収率を予想よりも低くする場合、その製品は LAL 試験を阻害します。予想よりも高い値を引き起こす製品は増強します。製品の阻害特性と増強特性を克服することは、注射剤や医療機器の最終出荷試験で使用する LAL 試験の検証の一環として FDA によって義務付けられています。LAL を使用して製品を出荷する前に、適切なエンドトキシン回収率が証明されなければなりません。^[11]

LAL 検査は、バイオメディカル産業における動物製品依存の主な原因であり、動物を用いた検査に関する科学の3Rに対する挑戦です。予想よりも高い死亡率が報告されているため^[7]、検査の代替手段を考案する方が倫理的であると考えられてきました。^[12] 2003 年以降、 LAL 検査で使用するための組み換えタンパク質代替品が市販されています。組み換え因子 C (rFC) アッセイと名付けられたこのアッセイは、同じリムルス凝固因子 Cタンパク質に基づいていますが、遺伝子組み換え昆虫細胞によって生成されます (使用される特定の因子 C 配列は、必ずしも大西洋カブトガニ由来ではありません)。^[5]

rFC検査では、凝固経路全体をエミュレートするのではなく、因子Cに合成蛍光基質を切断させ、エンドトキシンが因子を活性化するとサンプルが光るようにします。因子Gを含まないため、(1,3)-β-D-グルカンは偽陽性を引き起こしません。2018年現在、入手可能な証拠はrFC検査がLAL検査よりも悪くないことを示しています。^[13]

rFC検査の採用は遅かったが、2012年に米国FDAと欧州保健省がこれを代替手段として認めたことで状況は変わり始めた。生産現場で検査を実施するための適切な基準がなかったため、薬局方に記載されていないことが問題となっていた。^{[13] 2016年に、rFCは}欧州薬局方に追加されました。^[5] rFCの特許も、2018年の期限切れまで採用を制限していました。^[13]

2020年6月1日、米国薬局方（USP）は、第85章「細菌性エンドトキシン」にエンドトキシン試験の組み換え技術を含める提案を取り消し、組み換え由来の試薬に基づくエンドトキシン試験の使用、検証、比較可能性を拡張する別の章の開発を開始することを決定しました。USPによって別のガイダンスのみの章1085.1が提案されましたが、2020年12月11日に公開されたコメントとフィードバックによると、製薬会社とFDAはこの章を支持しておらず、公定書としての地位を要求しています。^[14]

単球活性化試験（MAT）は、ヒトの血液中の単球に基づいてエンドトキシンを検査するために提案されている別の方法です。この試験は、発熱物質の存在により単球から放出されるサイトカインを測定します。基本的に、これらの毒素がヒト（および元の発熱物質試験と同様にウサギ）に発熱を引き起こすプロセスを反映しています。^[15]培養細胞を使用するMAT試験のプロトコルは、欧州薬局方に記載されています。^[16]

遺伝子組み換え単球を用いた最近の研究では、単球ベースの検出アッセイの感度を大幅に向上させ、アッセイ完了時間を20時間以上から2～3時間に短縮することができました。^[17]

• リムルス凝固酵素
• リポ多糖類

• ホースシュークラブ
• LAL アップデート
• エンドトキシン検出製品 2010年7月14日アーカイブウェイバックマシン
• 1987 FDA LAL テストガイドライン
• LALテスト試薬