脱パイロジェン

脱発熱物質処理とは、溶液、最も一般的には注射用医薬品から 発熱物質を除去することを指します。

発熱物質は、発熱を引き起こす可能性のある物質と定義されます。細菌性発熱物質には内毒素と外毒素が含まれますが、多くの発熱物質は宿主にとって内因性です。内毒素には、グラム陰性細菌の細胞壁の一部として見られるリポ多糖(LPS) 分子が含まれ、細菌細胞の溶解時に放出されます。内毒素は、通常は存在しない血流やその他の組織に放出されると、発熱性になることがあります。結腸にはグラム陰性細菌が豊富に存在しますが、細菌が著しく溶解することはなく、結腸壁が無傷である間は免疫系が遊離内毒素にさらされないため、発熱効果は引き起こしません。

細菌細胞が溶解してLPSが放出されると、脂質A成分はまず血清LPS結合タンパク質（LBP）に結合し、次にCD14（血清中の遊離CD14、またはマクロファージや単球の細胞表面に結合したCD14）に転移する。LPS受容体Toll様受容体4（TLR4）は凝集したLPSを認識できないため、これにより凝集したLPSが単量体化される。次に単量体LPSは、マクロファージと単球上のTLR4とあらかじめ複合体を形成したMD-2に転移する。これにより炎症誘発性サイトカインと一酸化窒素が放出され、反応の強さによっては最終的に敗血症性ショックを引き起こす可能性がある。血管内皮細胞もTLR4とMD-2を発現しているため、サイトカインや一酸化窒素を介してだけでなく、直接LPSに反応する。気管支上皮細胞と結腸上皮細胞も TLR4 を発現しますが、MD-2 を発現しないため、LPS にシグナルを送るには血清 MD-2 と事前に複合した LPS に依存します。

エンドトキシンの分子量は大きく異なるため (10,000 ～ 1,000,000 Da)、エンドトキシン レベルは「エンドトキシン ユニット」(EU) で測定されます。1 EU は、約 100 pg の大腸菌リポ多糖に相当します。これは、約 10 ^{5 個}の細菌に含まれる量です。人間は、体重 1 kg あたり 5 EU の曝露でも症状を発症する可能性があります。これらの症状には、発熱、低血圧、心拍数の増加、尿量の低下などが含まれますが、これらに限定されません。血流中のエンドトキシンが少量であっても、多くの場合は致命的です。

米国食品医薬品局は、米国で流通する医薬品に対して、以下の最大許容エンドトキシン濃度を設定しています。

• 薬剤（注射剤、髄腔内） - 体重1kgあたり0.2 EU
• 薬剤（注射剤、非脊髄内） - 体重1kgあたり5EU
• 滅菌水 - 0.25～0.5 EU/ml（使用目的によって異なります）

エンドトキシンの初期検出は、ウサギにサンプルを注射し、体温の反応を観察することで達成されました。ウサギはエンドトキシンに対する耐性が人間と似ているため、理想的な選択肢でした。しかし、この方法はコストがかかり、時間がかかり、動物愛護活動家からの抗議を引き起こしました。しかし、おそらくこのテストの最大の欠点は、エンドトキシンのレベルを定量化できないことでした。

現在、エンドトキシン検出の一般的な方法の 1 つは、リムルス アメーバサイト ライセート(LAL) テストです。このテストは、カブトガニの血液がエンドトキシンにさらされると凝血塊を形成するという Frederik Bang 博士の観察に基づいています。^[1]カブトガニの血液から抽出したアメーバサイトを、エンドトキシン汚染が疑われるサンプルと混合し、エンドトキシンが存在する場合に反応を観察します。FDA は、ゲル凝血、濁度測定、比色測定、および発色測定の 4 つの LAL テストのバリエーションを承認しています。これらのバリエーションの違いは、アメーバサイト/エンドトキシン反応の特性を示しています (例: ゲル凝血では沈殿物が生成され、比色測定では色が変わります)。このテストは迅速 (約 30 分) で、感度が非常に高い (感度 0.001 EU/ml まで)。ただし、LPS エンドトキシンのみを検出するため、一部の発熱性物質を見逃す可能性があります。また、特定の条件（最適ではないpH条件や不適切な陽イオン濃度）は偽陰性につながる可能性があります。炭水化物クロマトグラフィーマトリックスからのグルカンも偽陽性につながる可能性があります。^[2]

2003年以来、LAL検査の合成代替品が市販されています。この組み換えC因子（rFC）検査は、LALのLPS感受性部分であるリムルス凝固因子Cに基づいています。この検査の採用は遅かったが、2016年に欧州薬局方がこの検査を細菌毒素検査として承認したことで変化が始まりました。^[3]

単球活性化試験（MAT）は、ヒトの血液中の単球を試験管内で使用して発熱物質を検出する試験です。この試験は2010年に欧州薬局方に追加され、2012年にFDAに承認されました。^[4]

発熱物質は分子量の変動が大きいため、溶液から除去することが難しい場合が多い。また、発熱物質は熱に対して比較的安定しており、pHの変化の影響を受けにくい。しかし、いくつかの除去技術が存在する。^[5]

エンドトキシンは負に帯電しており、陰イオン交換体に結合します。対象物質も負に帯電していなければ、エンドトキシンより先にカラムを通過し、効率的な分離が達成されます。この方法は、アルブミンの精製に時々使用されます(詳細は後述)。エンドトキシンに対する親和性が知られているリガンドを陰イオン交換システムに結合させることで、エンドトキシン結合強度を高め、最終製品の純度をさらに向上させることができます。エンドトキシン結合リガンドの代表的な例としては、ヒスタミン、窒素含有複素環式化合物、ポリミキシン Bなどがあります。ただし、ポリミキシン B は外因性発熱物質であるインターロイキン-1 の生成を誘発することが知られているため、使用する場合は最終製品にポリミキシン B が存在しないことが示されなければなりません。

陰イオン交換クロマトグラフィーを用いたアルブミンの精製例： ^[6]

• エンドトキシンの 2% はカラムに結合しません。ただし、この 2% はアルブミンのピークの前に洗い流されるため、この 2% が洗い流された後に収集を開始するだけで除去できます。
• カラムに結合したエンドトキシンの 10% (元の合計の 9.8%) は、アルブミンのピーク後に最終的に洗い流されます。これが起こる前に収集を停止することで、最終製品へのエンドトキシンの混入を防ぐことができます。
• 結合したエンドトキシンの残りの90％（元の合計の88.2％）は、NaOHを使用してカラムから除去する必要があります。

陰イオン交換の代替法として陽イオン交換クロマトグラフィーがあり、正に帯電した溶質が固体クロマトグラフィー媒体に結合します。この方法では、エンドトキシンの代わりにターゲットがカラムに結合します。その後、エンドトキシンはカラムを通過し、純粋なターゲットがカラムから溶出されます。陽イオン交換クロマトグラフィーは、β-インターフェロンを効果的に精製することが示されています。（Dembinski ら）^[7]

エンドトキシンの分子量は通常 10 kD を超えるため、サイズに基づく分離を行うために限外濾過が使用されることがあります。エンドトキシンのサイズは変動が大きいため、適切な膜を選択することが難しい場合があります。そのため、この方法は、存在するすべてのエンドトキシンが 300,000 Da を超える場合にのみ使用するのが最適です。市販の限外濾過器は、0.001 EU/ml 未満のレベルまで発熱物質を除去できることが示されています。^{[引用が必要]}

この方法も、エンドトキシンの分子量が大きく、熱安定性があることに基づいています。低分子量の溶媒は、沸騰させて凝縮した蒸気をエンドトキシンフリーの容器に集めることで簡単に精製できます (以下の「加熱」を参照)。大きな LPS 分子は簡単に蒸発しないため、加熱容器に残ります。これは水の浄化に最適な方法です。

発熱物質は除去が難しいことが多いため、LPS 分子の不活性化または破壊が望ましい場合もあります。

この方法は、LPS 分子内の多糖類から脂質 A を切断することがわかっています (右図参照)。脂質部分だけでは水に溶けません。そのため、内皮細胞に結合できず、不活性になります。ただし、酸塩基加水分解は標的タンパク質を変性させる可能性があるため、タンパク質の精製には適していません。

過酸化水素を使用した酸化は、低コストの発熱物質破壊溶液としてよく使用されます。この破壊のメカニズムは不明ですが、過酸化水素は精製プロセスの下流で簡単に除去できるため、発熱物質の除去に有効な方法です。ただし、酸塩基加水分解と同様に、タンパク質の精製には適していません。

加熱法は、ガラスやその他の実験器具に発熱物質が付着していないことを確認するためによく使用されます。熱は、脱発熱プロセス専用に設計された乾熱オーブンで焼くことによって適用されます。エンドトキシンは比較的熱的に安定していますが、十分な加熱 (250 °C、30 分) により、エンドトキシン レベルが3 桁減少します。温度レベルが高いため、この方法はタンパク質の精製には適していません。

タンパク質を精製する場合、水酸化ナトリウム (NaOH) などのアルカリを安全かつ効果的に使用できます。また、オートクレーブできない機器 (プラスチックなど) やクロマトグラフィーカラムの脱パイロジェン化にも広く使用されています。実際、アニオン交換器を使用してパイロジェンを除去する場合、バッチごとに NaOH でカラムを洗浄する必要があります。

工場の従業員を含め、製造プロセスに関係するほぼすべての原材料は発熱物質汚染の潜在的な発生源となる可能性があるため、原材料のスクリーニングと脱発熱物質処理は、最終製品に発熱物質が含まれないことを保証し、コストのかかる除去や不活性化方法を必要としないという点で、非常に役立ちます。化学物質と緩衝液の限外濾過、適切な衛生管理方法の適用、定期的なテストの実施はすべて役立ちます。

• エンドトキシン
• 下流処理

• Sofer, G.; Hagel, L. (1997)。プロセスクロマトグラフィーハンドブック: 最適化、スケールアップ、検証ガイド。Academic Press、158-161。ISBN 0-12-654266 -X 
• Tours, N. および Sandle, T. 3 種類のグラム陰性細菌エンドトキシンを使用した乾熱脱パイロジェンの比較、European Journal of Parenteral and Pharmaceutical Sciences、第 13 巻、第 1 号、2008 年、pp. 17–20

• LAL アップデート
• 脱パイロジェンLALアップデート
• FDA 規制局: 検査技術ガイド、細菌性エンドトキシン/発熱物質
• 細菌学の教科書
• カブトガニの医療用途
• 細菌エンドトキシンを用いた脱発熱研究への実践的アプローチ