ほうれん草アプタマー

RNA を蛍光で追跡する必要性は、複雑な細胞機能におけるその役割がmRNA、rRNA、tRNAだけでなく、 RNAi、siRNA、snoRNA、lncRNAなどにも及ぶようになったことから高まってきました。 ^[1]^[2] Spinach は、細胞レベルで RNA の役割を研究する方法の必要性から生まれた、合成由来の RNA アプタマーです。^{[3]このアプタマーは、in vitro 進化としても知られる Systematic Evolution for Ligands by EXponential enhancement (}SELEX )を使用して作成されました。^[4]

RNA アプタマー Spinach の設計に使用された SELEX 法。 — SELEX法。

アプタマーは緑色蛍光タンパク質（GFP）のRNA模倣体として設計されました。タンパク質のGFPと同様に、SpinachはRNAを蛍光標識し、生体内で追跡するために使用できます。目的のRNA配列の後にSpinach配列を挿入する方法は容易に利用できます。^[5]^[6]

GFP の蛍光体は、β バレル構造内の 3 つの環状アミノ酸 (セリン 65、チロシン 66、グリシン 67) で構成されています。この構造、4-ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン (HBI) は、SELEX 研究で使用された合成類似体の基礎となりました。この構造の多くの誘導体が SELEX を使用してスクリーニングされましたが、選択された蛍光体、3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン(DFHBI) は、ホウレンソウとみなされる RNA 配列 24-2 に結合した場合に、高い量子収率(0.72)で最良の選択的蛍光を示しました。

DFHBI はフェノレートの形でのみホウレンソウに結合することが判明しました。pH < 6.0 では、フェノールとフェノレートの両方の形態が検出されます。pH = 6.0 では、フェノレートのピークのみが検出されます。DFHBI は、HBI や EGFP と比較して、非常に堅牢で、長期間にわたって光退色に抵抗します。結合したリガンドと結合していないリガンドの自由な交換により、この持続が可能になると考えられています。GFP とその誘導体の蛍光体はタンパク質の一部に共有結合しているため、自由な交換は発生せず、光退色が発生します。

ほうれん草は、2 本のらせん状の鎖と、G 四重鎖モチーフを持つ内部隆起部を持つ 84 ヌクレオチド長の構造です。蛍光体が結合するのはこの G 四重鎖です。結晶構造データに基づくと、蛍光体が結合して分子を収容すると、隣接する塩基の大規模な再配置が発生します。ただし、この結合は、通常は不安定な領域、つまり内部隆起部での塩基のスタッキングを促進するため、好ましいものです。GFP と同様に、DFHBI も脱水されており、これが高い量子収率に貢献しています。

ほうれん草は、生体内でタンパク質や分子を感知するためにも適応されています。2つの結合部位を含む適応構造により、アプタマーの蛍光は（1）蛍光体と（2）タンパク質または小分子に制限されます。

参考文献

^ 「細胞におけるRNAの役割 - RNAi生物学 - マサチューセッツ大学メディカルスクール - ウースターのRNA治療研究所」www.umassmed.edu。2014年10月18日時点のオリジナルよりアーカイブ。
^ 「タンパク質合成におけるRNAの役割 - RNAi生物学 - マサチューセッツ大学メディカルスクール - ウースター校のRNA治療研究所」www.umassmed.edu。2014年10月10日時点のオリジナルよりアーカイブ。
^ Huang, H.; Suslov, NB; Li, NS; Shelke, SA; Evans, ME; Koldobskaya, Y.; Rice, PA; Piccirilli, JA (2014 年 8 月)。「G 四重鎖含有 RNA が GFP 様蛍光体の蛍光を活性化する。」(2014 年)。Nat . Chem. Biol . 10 (8): 686–691. doi :10.1038/nchembio.1561. PMC 4104137. PMID 24952597 。
^ Levine, HA; Nilsen-Hamilton, M (2007). 「SELEX の数学的分析」.計算生物学および化学. 31 (1): 11–35. doi :10.1016/j.compbiolchem.2006.10.002. PMC 2374838. PMID 17218151 .
^ Strack, Rita L; Disney, Matthew D; Jaffrey, Samie R (2013). 「スーパーフォールディング Spinach2 は、トリヌクレオチド反復配列を含む RNA の動的性質を明らかにする」。Nature Methods . 10 (12): 1219–1224. doi :10.1038/nmeth.2701. ISSN 1548-7091. PMC 3852148. PMID 24162923 .
^ Paige, JS; Wu, KY; Jaffrey, SR (2011). 「緑色蛍光タンパク質のRNA模倣物」. Science . 333 (6042): 642–646. Bibcode :2011Sci...333..642P. doi :10.1126/science.1207339. ISSN 0036-8075. PMC 3314379. PMID 21798953 .

外部リンク

ほうれん草プラスミド

[1] 「細胞におけるRNAの役割 - RNAi生物学 - マサチューセッツ大学メディカルスクール - ウースターのRNA治療研究所」www.umassmed.edu。2014年10月18日時点のオリジナルよりアーカイブ。

[2] 「タンパク質合成におけるRNAの役割 - RNAi生物学 - マサチューセッツ大学メディカルスクール - ウースター校のRNA治療研究所」www.umassmed.edu。2014年10月10日時点のオリジナルよりアーカイブ。

[3] Huang, H.; Suslov, NB; Li, NS; Shelke, SA; Evans, ME; Koldobskaya, Y.; Rice, PA; Piccirilli, JA (2014 年 8 月)。「G 四重鎖含有 RNA が GFP 様蛍光体の蛍光を活性化する。」(2014 年)。Nat . Chem. Biol . 10 (8): 686–691. doi :10.1038/nchembio.1561. PMC 4104137. PMID 24952597 。

[4] Levine, HA; Nilsen-Hamilton, M (2007). 「SELEX の数学的分析」.計算生物学および化学. 31 (1): 11–35. doi :10.1016/j.compbiolchem.2006.10.002. PMC 2374838. PMID 17218151 .

[StrackDisney2013-5] Strack, Rita L; Disney, Matthew D; Jaffrey, Samie R (2013). 「スーパーフォールディング Spinach2 は、トリヌクレオチド反復配列を含む RNA の動的性質を明らかにする」。Nature Methods . 10 (12): 1219–1224. doi :10.1038/nmeth.2701. ISSN 1548-7091. PMC 3852148. PMID 24162923 .

[PaigeWu2011-6] Paige, JS; Wu, KY; Jaffrey, SR (2011). 「緑色蛍光タンパク質のRNA模倣物」. Science . 333 (6042): 642–646. Bibcode :2011Sci...333..642P. doi :10.1126/science.1207339. ISSN 0036-8075. PMC 3314379. PMID 21798953 .