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カラムクロマトグラフィーは、分析化学において混合物の個々の成分（分析対象物）を分離するために用いられるクロマトグラフィー法です。混合物は溶媒（溶出液）によって移動相へと運ばれます。この移動相は、固体粒子（固定相）が充填されたカラム内を移動します。成分は固定相に異なる速度で吸着するため、カラムから異なるタイミングで溶出します。これにより成分が分離されます。
この技術は、さまざまな吸着剤（順相、逆相など）を幅広い溶媒で使用できるため、広く応用可能です。この技術は、マイクログラムからキログラムまでのスケールで使用できます。カラムクロマトグラフィーの主な利点は、コストが比較的低く、固定相を使い捨てできることです。後者は、リサイクルによる相互汚染や固定相の劣化を防ぎます。移動相は、重力、圧縮ガス、または加圧ポンプ（高性能液体クロマトグラフィーと同様）によって移動します。
カラムクロマトグラフィーを行う前に、通常は少量の試料を用いて薄層クロマトグラフィーを行い、化合物の混合物がカラムクロマトグラフィーで精製された際にどのような挙動を示すかを確認します。これにより、実験者はその試料に最適な移動相と固定相の組み合わせを見つけることができます。
カラムは、円筒形のガラス管またはプラスチック管に固体吸着剤を充填して作製する。カラムのサイズは、分離する化合物の量によって決まる。管の底部には、固相を保持するためのフィルターが設けられている。フィルターは、綿またはグラスウール製の栓、あるいはガラスフリットのいずれかである。カラムの上部には、溶媒リザーバーを取り付けることができる。
カラムの準備には、一般的に乾燥法と湿潤法の2 つの方法が用いられます。乾燥法では、まずカラムに乾燥した固定相粉末を充填し、次に移動相を加えてカラムが完全に湿潤するまで流し込み、この時点から決して乾いた状態にしないようにします。[ 1 ]湿潤法では、溶離液と固定相粉末のスラリーを調製し、それを慎重にカラムに注ぎます。シリカの上部は平らである必要があり、シリカの上部は砂の層で保護することができます。溶離液をゆっくりとカラムに通して有機物を移動させます。
個々の成分は、固定相によって異なる保持を受け、溶離液とともにカラム内を異なる速度で流れる間に互いに分離されます。カラムの終端では、成分は一つずつ溶出されます。クロマトグラフィーの全工程において、溶離液は一連のフラクションとして収集されます。フラクションは、フラクションコレクターによって自動的に収集できます。クロマトグラフィーの生産性は、複数のカラムを同時に稼働させることで向上させることができます。この場合、マルチストリームコレクターが使用されます。溶離液の流れの組成を監視し、各フラクションについて、例えば分析クロマトグラフィー、UV吸収スペクトル、または蛍光によって溶解化合物を分析することができます。着色化合物（またはUVランプを用いた蛍光化合物）は、ガラス壁を通して移動するバンドとして観察できます。
カラムクロマトグラフィーでは、カラムには固体粒子、微粉末、またはゲルが充填されています。これは固定相または吸着剤と呼ばれます。多くの場合、シリカゲルまたはアルミナでできています。過去にはセルロース粉末がよく使用されていました。
イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（RP）、アフィニティークロマトグラフィー、膨張床吸着法（EBA）など、さまざまなカラムクロマトグラフィーに対応するため、幅広い種類の固定相が利用可能です。EBAでは流動床が使用されますが、表面積を増やすために固相は微細多孔質である場合もあります。
一般的に、分析対象混合物よりもはるかに多くの固定相を使用する必要があります。特にシリカカラムクロマトグラフィーでは、分析対象混合物の乾燥質量1グラムあたり、20～100グラムの固定相が必要です。シリカを多く使用するとクロマトグラフィーの分離能は向上しますが、速度も遅くなります。[ 2 ]
移動相または溶出液とは、化合物をカラムを通して移動させるために使用される溶媒または溶媒混合物のことである。
適切な溶離液を選択する際の主な基準は、保持係数に関するものである。
適切な溶離液を選ぶには、多くの場合、同じ固定相を用いた薄層クロマトグラフィー（TLC）で、極性の異なる溶媒を用いて、適切な溶媒系が見つかるまで、小規模な予備試験を複数回実施する。
一般的な移動相溶媒は、極性の低い順に、ヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、アセトン、メタノールである。[ 3 ]一般的な溶媒系はヘキサン：酢酸エチルの混合物である。目的化合物の保持係数が0.2～0.3になるように比率を調整する。
よくある誤解とは異なり、メタノール単独でも極性の高い化合物の溶離液として使用でき、シリカゲルを溶解することはありません。
溶離液の流量は最適化できます。溶離液の流量を高くすると、カラムの運転時間が短縮され、拡散が抑制されるため、分離能が向上します。ただし、流量が高すぎると、分析対象物質が固定相と移動相の間で平衡状態に達しなくなります（Van Deemterの式を参照）。
重力流カラムクロマトグラフィーの流量を増やすには、固定相の上端より上の新鮮な溶離液カラムの高さを上げるか、タップコントロールを下げるかのいずれかの方法があります。また、ポンプを使用したり、圧縮ガス（空気、窒素、アルゴンなど）を使用して溶媒をカラムに通すことによっても流量を増やすことができます（フラッシュカラムクロマトグラフィー）。[ 4 ] [ 5 ]
一般的に、フラッシュカラムクロマトグラフィーでは、重力カラムクロマトグラフィーよりも固定相の粒子サイズが細かい。例えば、前者の手法で最も広く使用されているシリカゲルのグレードの1つはメッシュ230～400（40～63μm）であるのに対し、後者の手法では通常、メッシュ70～230（63～200μm ）のシリカゲル が必要となる。 [ 6 ]
カラムクロマトグラフィーは時間がかかる。Biotage、Buchi、Interchim、Teledyne Iscoなどの多くのメーカーは、精製プロセスにおける人的介入を最小限に抑える自動フラッシュクロマトグラフィーシステムを開発している。
このようなシステムは一般的に低圧液体クロマトグラフィー（LPLC）と呼ばれます。これらは、グラジエントポンプ、サンプル注入ポート、UV検出器、溶出液を回収するフラクションコレクターなど、より高価な高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）システムに通常搭載されているコンポーネントを備えていますが、より低い圧力（通常350～525 kPaまたは50.8～76.1 psi）で動作します。これらの自動システムは、数ミリグラムから工業規模の数キログラムまでのサンプルを分離することができ、分取HPLCシステムで複数回注入するよりも安価で高速です。
LPLCシステムの分解能（または混合物を分離する能力）は、HPLCカラムの充填材がはるかに小さく、通常はわずか5マイクロメートルであるため、低くなります。これにより、相互作用のための固定相表面積が増加し、分離が向上します。しかし、充填材が小さいと背圧が高くなるため、「高圧」液体クロマトグラフィーと呼ばれます。
LPLCカラムは通常、約50マイクロメートルのシリカで充填されているため、背圧と分離能が低下するだけでなく、高価な高圧ポンプも不要になります。現在、メーカーは1MPa（150psi）を超える高圧で動作するフラッシュクロマトグラフィーシステムへの移行を開始しており、これを「中圧液体クロマトグラフィー」（MPLC）と呼んでいます。
一般的に、カラムクロマトグラフィーは、蠕動ポンプ、緩衝液、および溶液サンプルをカラム上部から流す装置で構成されます。溶液と緩衝液はカラムを通過し、カラム装置の終端にある分画コレクターで溶出されたサンプルが回収されます。分画回収に先立ち、カラムから溶出されたサンプルは分光光度計や質量分析計などの検出器を通過し、サンプル溶液混合物中の分離されたサンプルの濃度が測定されます。
例えば、カラムへの結合能が異なる2種類のタンパク質を溶液サンプルから分離する場合、280 nmの波長を用いる分光光度計が適切な検出器となるでしょう。カラムを通過する溶出液中のタンパク質濃度が高いほど、その波長における吸光度も高くなります。
カラムクロマトグラフィーでは、溶出液が一定流量で検出器を通過する際に濃度が変化するため、検出器は溶出液の濃度を時間経過とともにプロットする必要があります。この試料濃度と時間の関係を示すグラフをクロマトグラムと呼びます。
クロマトグラフィーの究極の目的は、溶液混合物から異なる成分を分離することです。分離度は、混合物中の成分間の分離の程度を表します。クロマトグラムの分離度が高いほど、カラムによる試料の分離度が高いことを意味します。このデータは、特定の試料に対するカラムの分離特性を判断する良い方法です。分離度はクロマトグラムから計算できます。
図中の各曲線は、カラム樹脂への親和性に基づいて、時間経過に伴う異なる試料溶出濃度プロファイルを表しています。分離度を計算するには、保持時間と曲線幅が必要です。
保持時間とは、検出器による信号検出の開始から、各サンプルの溶出濃度プロファイルのピーク高さに達するまでの時間のことです。
曲線幅とは、クロマトグラムにおける各サンプルの濃度プロファイル曲線の幅を時間単位で表したものです。
クロマトグラムの分離度を計算する簡略化された方法は、プレートモデルを使用することです。[ 7 ]プレートモデルでは、カラムを一定数のセクション、つまりプレートに分割でき、各プレートごとに質量バランスを計算できると仮定します。このアプローチでは、典型的なクロマトグラム曲線をガウス分布曲線として近似します。これにより、曲線の幅は曲線の標準偏差の4倍、4σとして推定されます。保持時間は、信号検出の開始からガウス曲線のピーク高さまでの時間です。
上の図の変数から、カラムプレートモデルの解像度、プレート数、およびプレート高さを計算することができる。
解決、 どこ
ナンバープレート番号。
プレートの高さ、 どこは列の長さです。[ 7 ]
吸着カラムの場合、カラム樹脂（固定相）はマイクロビーズで構成されています。タンパク質、炭水化物、金属イオン、その他の化学化合物などのさらに小さな粒子もマイクロビーズに結合されます。マイクロビーズに結合した各結合粒子は、精製または分離が必要な溶質サンプルと1：1の比率で結合すると考えられます。
分離対象分子とカラムビーズ上の結合分子との結合は、単純な平衡反応K eq = [CS]/([C][S]) を使用してモデル化できます。ここで、K eqは平衡定数、[C] と [S] はそれぞれカラム樹脂上の対象分子と結合分子の濃度です。[CS] はカラム樹脂に結合した対象分子の複合体の濃度です。[ 7 ]
これを基礎として、カラムクロマトグラフィーの結合ダイナミクスを記述するために、線形、ラングミュア、フロイントリッヒの3つの異なる等温線を用いることができる。
直線等温線は、精製する必要のある溶質濃度が結合分子に比べて非常に小さい場合に発生します。したがって、平衡は次のように定義できます。
工業規模での使用においては、カラム樹脂ビーズ上の結合分子の総数を考慮に入れる必要があります。これは、未占有部位を考慮に入れる必要があるためです。ラングミュア吸着等温式とフロイントリッヒ吸着等温式は、この平衡状態を記述するのに役立ちます。ラングミュア吸着等温式は次のように表されます。
フロイントリッヒ等温線は次のように表される。
フロイントリッヒ等温線は、精製が必要な溶液中の多くの異なるサンプルがカラムに結合する場合に使用されます。多くの異なるサンプルはビーズに対して異なる結合定数を持つため、多くの異なる K eqが存在します。したがって、この場合、ラングミュア等温線は結合の良いモデルではありません。[ 7 ]
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