微分動的顕微鏡法

差分動的顕微鏡法（DDM）は、従来の光学顕微鏡を用いて光散乱のような実験を行うことができるイメージングベースの光学技術です。顕微鏡画像の時系列を使用して、動的光散乱（DLS）実験で得られるものと同様に、さまざまな長さスケールと時間遅延にわたる微視的な変動に関する動的情報を抽出します。^{[ 1 ] [ 2 ]} DDMは、液体、ゲル、コロイドやポリマーの懸濁液、液晶などの典型的な軟質材料に適しており、細菌や細胞を含むさまざまな生物システムに適用されています。

DDM技術は、高速カメラを搭載した顕微鏡を使用してコロイド粒子の波数ベクトル分解ダイナミクスを調査する方法として、2008年にCerbinoとTrappeによって導入され、DLSで得られるものと同様の動的情報が、実空間で撮影されたタイムラプス画像から抽出できることが実証されました。^{[ 1 ]}この基礎的な論文は、DDMがイメージング機能と散乱ベースの波数ベクトル解析を組み合わせる独自の能力を確立したことで、多くの引用を集めています。その後まもなく、Giavazziらは、蛍光に基づく他のイメージングモダリティへの拡張について議論し、DDMと関連するイメージングベースの散乱法との関連性を明らかにしました（以下の「他のイメージングベースの散乱法との関係」のセクションを参照）。^{[ 2 ]}

その後の研究では、DDM を細菌の運動性や微生物のダイナミクスの特性評価に適用し、単一粒子追跡なしで集団平均遊泳速度やその他の運動性パラメータを取得できることを示しました。^{[ 3 ] [ 4 ]}

DDMは共焦点蛍光顕微鏡にも拡張され、濃縮された多重散乱蛍光システムや能動的に駆動される蛍光システムを特徴づけることができ、アクセス可能なサンプルとイメージングモダリティの範囲が広がった。^{[ 5 ]}

2014年、GiavazziとCerbinoは、ソフトマターダイナミクスのためのデジタルフーリエ顕微鏡法についてより広い視点を提供し、DDMを顕微鏡画像シーケンスから散乱情報と動的情報を抽出するフーリエ空間アプローチのより広いファミリーの中に位置づけた。^{[ 6 ]}

この技術が成熟するにつれて、包括的なレビューによってこの分野が確立されました。2017年に、CerbinoとCicutaは、複雑な流体や生物系におけるマルチスケールの活動を抽出するDDMの能力を強調する展望記事を発表し、さまざまな長さスケールにわたるダイナミクスを定量化するためのバイアスのないツールとして確立しました。^{[ 7 ]}その後、2022年に、Cerbino、Giavazzi、Helgesonは、特にポリマーシステムへのDDMの応用をレビューし、ポリマー溶液、ゲル、複合材料の特性評価におけるその使用法を詳細に説明しました。^{[ 8 ]}

DDM の分野横断的な導入を支援するために、教育的な導入と再現可能なワークフローが開発されています。最近の展望記事では、標準的な顕微鏡ビデオを使用して高分子や粒子の拡散係数を測定する新しいアプローチとして DDM をレビューし、空間分解拡散測定の実際的な制約と可能性について議論しています。^{[ 9 ]} 2 つのサンプルデータセットと分析スクリプトを含む DDM のチュートリアル形式のプレゼンテーションは、American Journal of PhysicsでGermainらによって提供されています。^{[ 10 ]}

2025年には、 「差分動的顕微鏡法のヒッチハイカーズガイド」と題された包括的なチュートリアル記事が発表され、実験設計、データ取得、分析に関する段階的なガイダンスが提供され、オープンソフトウェアとサンプルデータセットによってサポートされる再現可能なワークフローが強調されました。^{[ 11 ]}

DDMは顕微鏡動画、つまり一連の画像から始まる。${\displaystyle I(\mathbf {r} ,t)}$試料内の固定面で取得される。重要な仮定は、記録された強度変動が、関心のある物理場（多くの場合、粒子の数密度、または蛍光標識構造）の変動に関連しており、顕微鏡の点像分布関数（PSF）によってぼやけている可能性があるということである。^{[ 1 ] [ 2 ]}

空間スケールを分離するために、各画像はフーリエ空間で解析される。変動は波数ベクトルでラベル付けされたモードに分解される。$\displaystyle \mathbf {q} }$特徴的な長さスケールに対応${\displaystyle \sim 2\pi /q}$ダイナミクスは、時間差を置いて撮影された画像を比較することによって定量化される。${\displaystyle \Delta t}$最も一般的な実装では、2 つの画像間の差分のフーリエパワースペクトルを計算します。${\displaystyle \Delta t}$そして、この量を多数のペアにわたって平均化することで統計精度を向上させます。これにより、画像構造関数が得られます。${\displaystyle D(q;\Delta t)}$これは、変動が相関しなくなるにつれて、短い遅延ではノイズ/バックグラウンドレベルから長い遅延ではプラトーまで増加する。^{[ 1 ] [ 2 ]}

標準条件下では、${\displaystyle D(q;\Delta t)}$正規化された中間散乱関数と関連付けることができる${\displaystyle f(q;\Delta t)}$つまり、DLSの中心となる動的相関関数と同じである。したがって、${\displaystyle \Delta t}$各段階における依存関係${\displaystyle q}$適切なモデル（拡散、移流/弾道運動、プロセスの混合）を用いることで、DDMは拡散係数、特性速度、緩和時間などの定量的パラメータを導き出す。^{[ 1 ] [ 2 ] [ 11 ]}

DDMは、特定の実験シナリオに適した独自のトレードオフを提供することで、従来の動的光散乱（DLS）および多粒子追跡（MPT）を補完します。^{[ 6 ] [ 9 ] [ 11 ]}

DLSに対する利点

波数ベクトル範囲： DDMは従来のDLS（通常0.1～5μm⁻¹）よりも低いq値に^アクセスできるため、より大きな粒子を特性評価する際に利点があります。

空間選択： DDMは関心領域（ROI）の選択を可能にし、空間的に不均一なサンプルや、アンサンブルDLS測定では困難または不可能な局所的なダイナミクスの測定を可能にします。

光学的な柔軟性： DDMは様々な顕微鏡コントラスト機構（明視野、位相差、蛍光、共焦点、偏光、暗視野）に対応していますが、DLSは通常レーザー光照射を必要とします。

粉塵に対する耐性： DDMは静止した粉塵粒子（例えば細胞表面上のもの）に耐性があり、多重散乱サンプルも良好に処理できます。一方、従来のDLSは粉塵に非常に敏感であり、迷光抑制が必要です。

試料量： DDMではマイクロリットル単位の試料しか必要としませんが、DLSでは通常ミリリットル単位の試料が必要です。

複数粒子追跡に対する利点

統計的検出力： DDMは視野内のすべての粒子を同時に解析することで優れたアンサンブル統計を提供します。一方、MPTはユーザーによる複雑な軌道再構築を必要とします。

サブ解像度感度： DDMは個々の粒子を光学的に分解する必要がないため、MPTでは困難な高濃度で光学的に密度の高いシステムでの測定が可能になります。

制限事項および実際的な制約

測定速度： DDMはDLS（数秒）に比べて取得に長い時間（数分から数時間）を要するため、迅速で日常的な測定にはDLSが好まれる。

分析時間：データ分析は計算負荷が高い。従来型のCPUベースの処理ではデータセットごとに数分から数時間を要していたが、最近のGPUアクセラレーションによる実装（例：fastDDM）ではこれを数秒に短縮し、高スループットのワークフローを実現している。

商業的な成熟度： DLSの機器とソフトウェアは成熟しており、広く入手可能です。一方、DDMには専用のセットアップ、または特殊な分析ソフトウェアを備えた市販の顕微鏡を改造する必要があります。

光学的コントラスト要件： DDMの性能は信号コントラストに大きく依存します。散乱性の低いサンプルでは、​​照明の最適化や蛍光標識を慎重に行う必要がある場合があります。

ダイナミックレンジのトレードオフ：アクセス可能な最低のq値（最長の長さスケール）は、長時間のデータ取得を必要とする非常に遅いダイナミクスに対応します。最高のq値は、高倍率と高フレームレートを必要とするため、顕微鏡の構成において実際的なトレードオフが生じます。

DDMフレームワークの妥当性を保証する濃度と強度の比例関係は、主に2種類のDDM実装において成り立つ。

散乱ベースの DDM :明視野、位相差、偏光イメージングのように、強い透過光と弱い散乱光との干渉によって画像強度が生じる。 蛍光ベースの DDM :蛍光イメージングや共焦点イメージングのように、標識された粒子または構造からの蛍光発光の非干渉的な加算によって画像が得られる。どちらのクラスでも、実空間での PSF との畳み込みは逆空間 (フーリエ) での単純な積となり、画像強度の特定のフーリエ モードを解析して対応する濃度モードのダイナミクスを抽出できる。粒子追跡とは異なり、DDM では個々の粒子を分解する必要がないため、サブ解像度の特徴のダイナミクスを特徴付けることができる。実空間で画像を取得すると、イメージング モダリティの柔軟な選択や静的イメージング アーティファクトに対する堅牢性など、従来の遠視野散乱法に比べて実用的な利点も得られる。

DDM解析は、光学的ゆらぎの研究の文脈で開発された微分動的アルゴリズム（DDA）に基づいています。^{[ 12 ] [ 13 ]}このアプローチでは、遅延によって分離された画像ペアが${\displaystyle \Delta t}$静止背景を抑制し、動きによる変化を強調するために、差分画像が減算されます。差分画像の2次元高速フーリエ変換（FFT）により、空間周波数全体にわたるダイナミクスのフーリエ空間表現が得られます。同じ背景を持つ多数の画像ペアにわたって得られたパワースペクトルを平均化します。${\displaystyle \Delta t}$（そして、等方性サンプルについては、波数ベクトル方向にわたって）画像構造関数を与える${\displaystyle D(q;\Delta t)}$理論分析によると、一般的な DDM モダリティ^{[ 2 ]の場合、}

どこ${\displaystyle f(q;\Delta t)}$は正規化された中間散乱関数であり、${\displaystyle I(q)}$は静的散乱強度であり、${\displaystyle B(q)}$は検出ノイズに関連する背景用語であり、${\displaystyle T(q)}$これは、顕微鏡の詳細や撮像条件に依存する伝達関数です。

単純なブラウン運動の場合、${\displaystyle f(q;\Delta t)=\exp(-Dq^{2}\Delta t)}$、 どこ${\displaystyle D}$は拡散係数です。方向性のある（弾道）運動、集団の混合、または速度の分布を含むモデルは、遊泳細菌などの能動システムで使用されます。^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]}

マルチDDMと呼ばれるバリアントは、従来の光散乱における散乱体積の変化に類似して、画像フレームのサブ領域を解析します。このバリアントは、ダイナミクスの空間的変化を明らかにすることができ、局所的なダイナミクスが位置によって大きく変化する生物学的ネットワークや相分離材料などの不均一なシステムを研究するのに特に価値があります。^{[ 14 ]}

2025年のチュートリアル記事「差分動的顕微鏡法へのヒッチハイカーズガイド」は、DDM実験と分析の段階的な実践ガイドを提供し、教育と再現性を目的としたオープンソースソフトウェアと公開アクセス可能なデータセットに関連付けられています。^{[ 11 ]}

このチュートリアルで使用される DDM 解析の実装は、オープンソースの Python パッケージfastDDMとして提供されており、ドキュメントとソースコードは GitHub でホストされています。^{[ 15 ]} fastDDM パッケージには、データセットごとに解析時間を数分から数秒に短縮する GPU アクセラレーション アルゴリズムが組み込まれており、これまで計算上の制約によって制限されていたハイスループット解析と実用的なアプリケーションが可能になります。^{[ 11 ]}作業例とチュートリアル ノートブックは、付属のリポジトリで提供されています。^{[ 16 ]} DDM チュートリアルで使用されるサンプル オープン データセットは、DOI 付きのアーカイブ データセットからも入手できます。^{[ 17 ]}

DDMは当初、希薄および濃縮懸濁液中のブラウン運動を行うコロイド粒子のダイナミクスを特徴づけるために使用され、デコヒーレンス率の波数ベクトル依存性から拡散係数やその他の流体力学的パラメータを抽出した。^{[ 1 ] [ 2 ]}

DDMは、ナノ粒子の凝集プロセスや異方性コロイドのダイナミクスなど、複雑な流体のダイナミクスを測定するために拡張されました。^{[ 18 ] [ 19 ]}

DDMは、細菌の運動と運動性を定量化するために広く応用されており、単一粒子追跡なしで、集団遊泳速度、拡散率、ラン・タンブル統計などのアンサンブル平均パラメータを提供します。^{[ 3 ] [ 4 ]}共焦点および蛍光実装により、濃縮系や多重散乱系を含む蛍光サンプルや光学的に困難なサンプルでの測定も可能になります。^{[ 5 ]}

主な応用分野は以下のとおりです。

粒子サイズとサイズ分布: DDM は、拡散係数を抽出し、ストークス-アインシュタイン方程式を介して流体力学的サイズに変換することにより、粒子サイズ測定に使用できます。これは、多峰性サイズ分布や混合物にも拡張でき、DDM は個々の粒子が分解されていない場合でもサイズ情報を提供します。^{[ 1 ] [ 2 ] [ 20 ]}

タンパク質のサイズ測定と高分子特性評価： DDMは、数ミリグラム/ミリリットルの希薄濃度でのタンパク質の特性評価に拡張され、わずか数マイクロリットルのサンプルで、市販のDLS装置と非常によく一致する流体力学的半径測定を実現しています。^{[ 21 ]}

濁った高濃度懸濁液： DDMは、広範囲の濃度と光学的厚さにわたる濁った懸濁液のダイナミクスを調べるために使用されており、従来の光散乱測定では困難なサンプルの分析を可能にしています。^{[ 22 ]}

マイクロレオロジーと粘度測定：トレーサー変動のDDM解析を使用して、トラッキングフリーのマイクロレオロジーとマイクロリットル粘度測定のバリアントが開発され、少量のサンプル量から粘度または粘弾性係数を決定できるようになりました。^{[ 23 ] [ 24 ] [ 25 ]}

生物学的および細胞骨格ネットワークのダイナミクス： DDMは、生体高分子および細胞骨格ネットワークのダイナミクスを定量化するために適用されており、顕微鏡画像シーケンスにおける緩和および再配置ダイナミクスのフーリエ空間ビューを提供します。^{[ 26 ]}

液晶相転移と配向秩序: DDM は、液晶系における配向ダイナミクスと前相転移ゆらぎを調べるために適用されてきました。閉じ込められたネマチックセルでは、DDM は相境界付近でのディレクターゆらぎと動的相関の変化を捉え、ネマチック領域における集団的な配向緩和と異方性ダイナミクスについての洞察を提供します。^{[ 27 ] [ 28 ]}

活性物質および非平衡物質: DDM は、ゲル^{[ 29 ]}や複数の緩和レジームを持つ動的に不均一なシステムなど、活性で非平衡なソフトマテリアルのマルチスケールダイナミクスを定量化するためにますます使用されています。関連する逆空間アプローチは、ガラス状コロイドに適用され、2 次元システムのマルチスケール不均一ダイナミクスを特徴付け、^{[ 30 ]}硬球ガラス中のトレーサー粒子のブラウン運動的だが非ガウス拡散を調査しています。^{[ 31 ]}生物学的活性物質では、DDM 由来の手法により、コンフルエントな単層における単一細胞の変位や分裂速度などの集団的細胞ダイナミクスの追跡不要の定量化が可能になり、^{[ 32 ]}ショウジョウバエ卵細胞質における細胞骨格活動によって駆動される能動拡散と移流を解析するために使用されています。^{[ 33 ]}

散乱ベースの DDM は、いわゆる近場(または深フレネル) 散乱ファミリー^{[ 34 ]}に属し、イメージングベースの散乱法のファミリーです。^{[ 35 ] [ 36 ]}ここで近場は、近場スペックルで使用されるのと同様の方法で使用されます。つまり、遠場またはフラウンホーファー領域とは対照的に、フレネル領域の特殊なケースとして使用されます。近場散乱ファミリーには、定量シャドウグラフィー^{[ 37 ]}およびシュリーレン^{[ 12 ]}も含まれます。