プライマー拡張

プライマー伸長は、 RNAの5' 末端をマッピングする、つまり配列を決定して適切に識別できる 技術です。

プライマー伸長は、配列がわかっている転写の開始部位を決定するために使用できます（この方法では終了部位は決定できません）。この技術には、mRNA の 3' 末端付近の領域に相補的な放射性標識プライマー（通常、長さ 20 - 50 ヌクレオチド）が必要です。プライマーを RNA にアニールさせ、逆転写酵素を使用してRNA からcDNA を合成し、RNA の 5' 末端に到達します。ハイブリッドを変性させ、伸長したプライマー cDNA を電気泳動ゲル上のマーカーとして使用することで、転写開始部位を決定することができます。これは通常、ゲル上の位置を DNA 配列と比較することによって行われ（例：サンガー配列決定）、できれば DNA テンプレート鎖上で同じプライマーを使用します。転写が開始する正確なヌクレオチドは、ゲル上で同じ移動距離を共有する標識された伸長プライマーとマーカーヌクレオチドを一致させることによって特定できます。

プライマー伸長は、RNA 転写産物の定量化とマッピングを行うためのヌクレアーゼ保護アッセイ(S1 ヌクレアーゼ マッピング)の代替手段となります。プライマー伸長のハイブリダイゼーション プローブは合成オリゴヌクレオチドですが、S1 マッピングでは DNA フラグメントの分離が必要です。どちらの方法も、mRNA がどこから始まるかの情報を提供し、結果として得られるオートラジオグラフ上の転写産物バンドの強度によって転写産物の濃度を推定します。ただし、S1 マッピングとは異なり、プライマー伸長は mRNA 転写産物の 5' 末端の位置を特定するためだけに使用できます。これは、アッセイに必要な DNA 合成が逆転写酵素に依存しているためです (5' → 3' 方向でのみ重合します)。

プライマー伸長はスプライス部位の影響を受けないため、介在するスプライス部位が S1 マッピングを妨げる状況ではプライマー伸長が適しています。最後に、S1 マッピングで使用されるS1 ヌクレアーゼはRNA-DNA ハイブリッドの末端を「かじり取る」か、一本鎖領域を完全に分解できず、転写産物が短くなったり長くなったりする可能性があるため、プライマー伸長は S1 マッピングよりも正確です。

• https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/primer-extension
• Shenk, TE, C. Rhodes, PWJ Rigby、および P. Berg。「シミアンウイルス 40 DNA における小さな欠失の生成のための生化学的手順」米国科学アカデミー紀要 72.4 (1975): 1392-396。印刷。