酵母人工染色体

酵母人工染色体（YAC）は、酵母サッカロミセス・セレビシエ[1]のDNAから派生した遺伝子組み換え染色体であり、細菌プラスミドに連結される。100～1000kbの大きなDNA断片を挿入することで、挿入された配列をクローニングし、染色体ウォーキングと呼ばれるプロセスを使用して物理的にマッピングすることができる。これは、ヒトゲノムプロジェクトで最初に使用されたプロセスであるが、安定性の問題により、YACは細菌人工染色体の使用に取って代わられた[2]。

パン酵母S. cerevisiaeは真核生物の分子遺伝学を研究するための最も重要な実験生物の一つである。^[1]

Rankinら、Strulら、Hsaioらによる初期の研究から始まり、本質的に脆弱な染色体は、必要な自律複製配列（ARS）を発見することによって安定化されました。^[2]このデータを利用した改良されたYACは、1983年にMurrayらによって説明されました。^[3]

YAC の主な構成要素は、 S. cerevisiae由来のARS、セントロメア[3]、テロメア[4]です。さらに、抗生物質耐性や可視マーカーなどの選択マーカー遺伝子は、形質転換された酵母細胞を選択するために利用されます。これらの配列がなければ、染色体は細胞外複製中に安定せず、ベクターのないコロニーと区別できなくなります。^[4]

工事

YACは、最初の環状DNAプラスミドを使用して構築されます。通常、制限酵素を使用して線状DNA分子に切断されます。次に、 DNAリガーゼを使用して、目的のDNA配列または遺伝子を線状DNAに連結し、単一の大きな環状DNA片を形成します。^[3] [5] 線状酵母人工染色体の基本的な生成は、6つの主なステップに分けることができます。

選択マーカーをプラスミドベクターに連結: これにより、マーカー遺伝子を持つコロニーと持たないコロニーの差別的選択が可能になります。抗生物質耐性遺伝子により、YAC ベクターを含む大腸菌が抗生物質の存在下で生存できるようにすることで、大腸菌内で YAC ベクターを増幅して選択することができます。外来 DNA 用の YAC ベクタークローニングサイトは、 SUP4遺伝子内にあります。この遺伝子は、赤色色素の蓄積を引き起こす酵母宿主細胞の変異を補います。宿主細胞は通常赤色で、 YAC のみで形質転換された細胞は無色のコロニーを形成します。外来 DNA フラグメントを YAC にクローニングすると、遺伝子の挿入不活性化が起こり、赤色が復元されます。したがって、外来 DNA フラグメントを含むコロニーは赤色です。^[5]
有糸分裂の安定性に必要なセントロメア配列の連結^[6]
自律複製配列（ARS）の連結により、有糸分裂複製を行うための複製起点が提供される。これによりプラスミドは染色体外で複製できるようになるが、プラスミドは有糸分裂に対して非常に不安定になり、セントロメア配列なしでは簡単に失われる。^[4]^[7]
環状プラスミドを線状DNAに変換するための人工テロメア配列の連結^[8]
増幅する DNA 配列の挿入 (最大 1000kb)
形質転換酵母コロニー^[9]

完全な染色体III

染色体IIIはS. cerevisiaeの中で3番目に小さい染色体であり、パルスフィールドゲル電気泳動法による研究からそのサイズは300～360kbと推定されている^[10]。

この染色体は、交配型の制御に関与する3つの遺伝子座、MAT、HML、HMRを含んでいることもあり、集中的な研究の対象となっている。^[11] 2014年3月、ニューヨーク大学ランゴーン医療センターのジェフ・ボークは、彼のチームがS. cerevisiaeの16酵母染色体のうちの1つ、染色体IIIを合成し、synIIIと名付けたことを発表した。^[12]^[13]この手順では、元の染色体の遺伝子を合成バージョンに置き換え、完成した合成染色体を酵母細胞に統合した。この操作には、元の染色体の316,667対よりも少ない、273,871塩基対のDNAの設計と作成が必要であった。

バイオテクノロジーにおける用途

YAC、 YIps（酵母統合プラスミド）、YEps （酵母エピソームプラスミド）などの酵母発現ベクターは、細菌人工染色体（BAC）に比べて、翻訳後修飾を必要とする真核生物タンパク質の発現に使用できるという利点があります。大きなDNA断片を挿入できるため、YACは生物のゲノム全体をクローン化して組み立てるために使用できます。^[14] YACを酵母細胞に挿入すると、線状人工染色体として増殖し、挿入されたDNA領域をその過程でクローン化できます。これが完了すると、2つのプロセスを使用して、配列決定されたゲノム、つまり関心領域を取得できます。

物理マッピング[6]
染色体ウォーキング^[15]

これはゲノムの特定領域の詳細なマッピングを可能にするという点で重要です。X染色体などのヒト染色体全体が検査され、^[16]多数の遺伝性疾患や形質の遺伝子マーカーの位置が生成されました。^[17]

1972 年にボリバルとロドリゲスがカリフォルニア大学サンフランシスコ校のボイヤー研究室で作成した pBR322 プラスミドの概略図。これは最初で最も広く利用されたベクターの 1 つであり、1983 年にマレーとショスタックが作成した YAC の基礎となっています。このプラスミドには、アンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子、および DNA 断片を挿入するための一連の制限酵素ターゲットサイトが含まれています。

ヒトゲノムプロジェクト

米国では、ヒトゲノム計画は、1988 年 2 月に国立研究会議 (NRC) の報告書「ヒトゲノムのマッピングと配列」の発表とともに初めて明確な形をとった。^[18] YAC は BAC よりも大幅に安定性が低く、「キメラ効果」、つまりクローン DNA の配列が実際には単一のゲノム領域ではなく複数の領域に対応するアーティファクトが生じる。キメラ現象は、複数のゲノムセグメントが単一の YAC に共連結されたこと、または同じ宿主酵母細胞で形質転換された 2 つ以上の YAC が組み換えられたことによる可能性がある。^[19]キメラ現象の発生率は 50% にも達する可能性がある。^[20]その他のアーティファクトには、クローン領域からのセグメントの削除、およびゲノムセグメントの再配置 (逆位など) がある。これらすべての場合において、YAC クローンから決定された配列は元の自然な配列と異なり、クローンの情報に頼ると、一貫性のない結果や解釈の誤りにつながる。これらの問題のため、ヒトゲノムプロジェクトは最終的にYACの使用を断念し、これらのアーティファクトの発生率が非常に低い細菌人工染色体に切り替えました。安定性の問題、特にキメライベントの比較的頻繁な発生に加えて、YACはヒトゲノム全体をカバーする最小タイリングパスを生成する際に非効率的であることが判明しました。クローンライブラリの生成には時間がかかります。また、適切なクローンを選択する際に参照ポイントとしてシーケンスタグサイト（STS）に依存するという性質上、ライブラリをさらに生成して埋めなければならない大きなギャップがあります。この追加の障害が、プロジェクトが代わりにBACを利用するきっかけとなりました。^[21]これは2つの要因によるものです：^[22]

BACは生成がはるかに速く、クローンの冗長ライブラリを生成する場合、これは不可欠です。
BAC により、STS によるより高密度のカバレッジが可能になり、より完全で効率的な最小タイリングパスが in silico で生成されます。

しかし、線虫C.エレガンスのゲノムで実証されたように、両方のアプローチを利用することは可能です。ゲノムの大部分はBACでタイル化され、ギャップはYACで埋められました。^[21]

参照

参考文献

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外部リンク

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ワシントン大学ゲノム研究所
サッカロミセスゲノムデータベース

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