ショットガンシーケンス

遺伝学において、ショットガン シーケンシングはランダムなDNA鎖をシーケンシングするために使用される手法です。ショットガンの弾丸が急速に広がる準ランダムな集団形成に似せて名付けられました。

DNA 配列決定の連鎖終結法(「サンガー配列決定」) は、100 ～ 1000塩基対の短い DNA 鎖にのみ使用できます。このサイズ制限のため、長い配列は個別に配列決定できる小さな断片に分割され、これらの配列が組み立てられて全体の配列が得られます。

ショットガンシーケンシングでは、^{[1] [2]} DNAはランダムに多数の小さなセグメントに分割され、チェーンターミネーション法を使用してシーケンスされ、リードを取得します。この断片化とシーケンスを数回実行することで、ターゲットDNAの複数の重複リードが得られます。次に、コンピュータープログラムは、異なるリードの重複末端を使用して、それらを連続したシーケンスに組み立てます。^[1]

ショットガンシーケンシングは、全ゲノムシーケンシングを可能にした先駆的な技術の 1 つでした。

たとえば、次の 2 ラウンドのショットガン リードを考えてみましょう。

この極めて単純化された例では、どのリードも元の配列の全長をカバーしていませんが、4 つのリードの末端の重なりを利用して整列および順序付けすることで、元の配列に組み立てることができます。実際には、このプロセスでは、あいまいさや配列エラーが満ち溢れた膨大な量の情報が使用されます。複雑なゲノムの組み立ては、反復配列が非常に多いためさらに複雑であり、類似した短いリードが配列のまったく異なる部分から来る可能性があります。

これらの困難を克服し、配列を正確に組み立てるには、元の DNA の各セグメントについて、多くの重複する読み取りが必要です。たとえば、ヒトゲノム プロジェクトを完了するために、ヒトゲノムの大部分は 12 倍以上のカバレッジで配列決定されました。つまり、最終配列の各塩基は平均して 12 の異なる読み取りに存在していました。それでも、現在の方法では、2004 年時点で、 （ユークロマチン）ヒトゲノムの約 1% について、信頼できる配列を分離または組み立てることができていません。 ^[3]

小さなゲノム（4000～7000塩基対）を対象とした全ゲノムショットガンシークエンシングは、1979年に初めて提案されました。^[1]ショットガンシークエンシングによって配列決定された最初のゲノムは、1981年に発表されたカリフラワーモザイクウイルスのゲノムでした。 ^{[4] [5]}

ペアワイズエンドシーケンシング（俗にダブルバレルショットガンシーケンシングとも呼ばれる）は、より幅広い応用に役立ちました。シーケンシングプロジェクトがより長く複雑な DNA 配列を扱うようになると、複数のグループが DNA 断片の両端をシーケンシングすることで有用な情報が得られることに気づき始めました。同じ断片の両端をシーケンシングしてペアのデータを追跡するのは、2 つの異なる断片の片方の端をシーケンシングするよりも面倒ですが、2 つの配列が反対方向を向いており、互いに断片の長さほど離れているという知識は、元の対象断片の配列を再構築する上で貴重でした。

歴史: ペアエンドの使用に関する最初の発表された記述は、1990年にヒトHGPRT遺伝子座のシーケンシングの一部として^[6]でしたが、ペアエンドの使用は、従来のショットガンシーケンシングアプローチを適用した後にギャップを閉じることに限られていました。一定の長さの断片を前提とした純粋なペアワイズエンドシーケンシング戦略の最初の理論的記述は、1991年でした^[7]。当時、ペアワイズエンドシーケンシングに最適な断片長は、シーケンスリード長の3倍であるというコミュニティのコンセンサスがありました。1995年にRoachら^[8]は、さまざまなサイズの断片を使用するという革新的な方法を導入し、純粋なペアワイズエンドシーケンシング戦略が大きなターゲットでも可能であることを実証しました。この戦略はその後、ゲノム研究所（TIGR）によって1995年にインフルエンザ菌のゲノム配列を決定するために採用され、 ^[9]その後、セレラ・ジェノミクスによって2000年にキイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）のゲノム配列が決定され、 ^[10]その後ヒトゲノムの配列が決定されました。

この戦略を適用するには、高分子量の DNA 鎖をランダムな断片に切断し、サイズを選択して (通常は 2、10、50、150 kb)、適切なベクターにクローン化します。次に、クローンの両端を連鎖終結法で配列決定し、2 つの短い配列を生成します。各配列はエンドリードまたはリード 1 とリード 2と呼ばれ、同じクローンからの 2 つのリードはメイトペアと呼ばれます。連鎖終結法では通常 500 ～ 1000 塩基長のリードしか生成できないため、最小のクローン以外ではメイトペアが重なることはほとんどありません。

元の配列は、配列アセンブリソフトウェアを使用して、リードから再構築されます。まず、重複するリードがコンティグと呼ばれる長い複合配列に収集されます。コンティグは、メイト ペア間の接続をたどることで、スキャフォールドにリンクできます。ライブラリの平均フラグメント長がわかっていて、偏差のウィンドウが狭い場合は、メイト ペアの位置からコンティグ間の距離を推測できます。コンティグ間のギャップのサイズに応じて、ギャップ内の配列を見つけるためにさまざまな手法を使用できます。ギャップが小さい (5-20kb) 場合は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) を使用して領域を増幅し、その後に配列決定を行う必要があります。ギャップが大きい (>20kb) 場合は、大きなフラグメントを細菌人工染色体(BAC)などの特別なベクターにクローン化し、その後にベクターの配列決定を行います。

このアプローチの支持者は、大規模なシーケンサーアレイを使用してゲノム全体を一度に配列決定できるため、従来のアプローチよりもプロセス全体がはるかに効率的になると主張しています。反対派は、この技術はDNAの大きな領域を迅速に配列決定できるものの、特に繰り返し領域を持つ真核生物ゲノムの場合、これらの領域を正しくリンクする能力に疑問があると主張しています。配列アセンブリプログラムがより洗練され、コンピューティングパワーが安価になれば、この制限を克服できる可能性があります。^[11]

カバレッジ（リード深度または深さ）は、再構築された配列内の特定のヌクレオチドを表すリード数の平均です。これは、元のゲノムの長さ（ G）、リード数（N）、平均リード長（L）から次のように計算できます。たとえば、平均長が500ヌクレオチドの8つのリードから再構築された2,000塩基対の仮想ゲノムは、2倍の冗長性を持ちます。このパラメーターにより、リードによってカバーされるゲノムの割合（カバレッジと呼ばれることもあります）など、他の量を推定することもできます。ショットガンシーケンスで高いカバレッジが望まれるのは、ベースコーリングとアセンブリのエラーを克服できるためです。DNAシーケンス理論の主題は、このような量の関係を扱っています。 ${\displaystyle N\times L/G}$

配列カバレッジと物理的カバレッジは区別されることがあります。配列カバレッジは、塩基が読み取られる平均回数です（前述のとおり）。物理的カバレッジは、塩基が読み取られる平均回数、またはメイトペアリードによってまたがる平均回数です。^[12]

ショットガンシーケンシングは理論上はどんなサイズのゲノムにも適用できるが、大規模ゲノム（例えばヒトゲノム）のシーケンシングへの直接適用は、技術の進歩によりプロセスに含まれる膨大な量の複雑なデータの処理が実用的となる1990年代後半まで限られていた。^[13]歴史的に、フルゲノムショットガンシーケンシングは、大規模ゲノムの巨大なサイズと、大規模ゲノムに存在する反復DNAの割合が高いこと（ヒトゲノムの場合は50％以上）によって追加される複雑さの両方によって制限されると考えられていた。^[14]大規模ゲノムのフルゲノムショットガンシーケンシングから信頼性の高いデータが得られるということは広く受け入れられていなかった。これらの理由から、ショットガンシーケンシングを実行する前に、シーケンスアセンブリの計算負荷を軽減する他の戦略を利用する必要があった。^[14] 階層的シーケンシング（トップダウンシーケンシングとも呼ばれる）では、実際のシーケンシングの前にゲノムの低解像度の物理マップが作成されます。このマップから、染色体全体をカバーする最小限の数の断片がシーケンシング用に選択されます。 ^[15]このようにして、最小限のハイスループットシーケンシングとアセンブリが必要になります。

増幅されたゲノムは、まず大きな断片（50～200kb）に切断され、BAC またはP1 由来の人工染色体（PAC）を使用して細菌宿主にクローン化されます。複数のゲノムコピーがランダムに切断されているため、これらのクローンに含まれる断片は末端が異なり、十分なカバレッジ（上記のセクションを参照）があれば、ゲノム全体をカバーするBAC コンティグの最小のスキャフォールドを見つけることが理論的には可能です。このスキャフォールドは、最小タイリングパスと呼ばれます。

タイリングパスが見つかると、このパスを形成するBACはランダムに小さな断片に切断され、ショットガン法を使用して小規模に配列決定することができます。^[16]

BAC コンティグの完全な配列はわかっていないが、互いの相対的な方向はわかっている。この順序を推測し、タイリング パスを構成する BAC を選択する方法はいくつかある。一般的な戦略としては、クローンの互いの位置を特定し、関心領域全体をカバーする連続した足場を形成するのに必要な最小数のクローンを選択することが含まれる。クローンの順序は、クローンの重なり方を判断することによって推測される。^[17]重なり合うクローンは、いくつかの方法で特定できる。配列タグ サイト(STS) を含む放射性または化学的に標識された小さなプローブを、クローンが印刷されているマイクロアレイにハイブリダイズすることができる。^[17]このようにして、ゲノム内に特定の配列を含むすべてのクローンが特定される。次に、これらのクローンの 1 つの末端を配列決定して新しいプローブを作成し、染色体ウォーキングと呼ばれる方法でこのプロセスを繰り返すことができる。

あるいは、BAC ライブラリを制限酵素で消化することもできます。いくつかの断片サイズが共通する 2 つのクローンは、複数の同様の間隔の制限部位が共通しているため、重複していると推測されます。^[17]このゲノムマッピング方法は、各クローンに含まれる制限部位のセットを識別するため、制限フィンガープリントまたは BAC フィンガープリントと呼ばれます。クローン間の重複が見つかり、ゲノムに対する順序がわかると、ゲノム全体をカバーするこれらのコンティグの最小サブセットのスキャフォールドがショットガンシーケンスされます。^[15]

階層的ショットガンシーケンシングは、最初にゲノムの低解像度マップを作成する必要があるため、全ゲノムショットガンシーケンシングよりも時間がかかりますが、全ゲノムショットガンシーケンシングほどコンピューターアルゴリズムに依存しません。ただし、大規模な BAC ライブラリの作成とタイリングパスの選択のプロセスにより、階層的ショットガンシーケンシングは時間がかかり、労働集約的になります。現在では、この技術が利用可能になり、データの信頼性が実証されているため、^[14]全ゲノムショットガンシーケンシングの速度とコスト効率により、ゲノムシーケンシングの主な方法となっています。

古典的なショットガン シーケンシングは、サンガー シーケンシング法に基づいていました。これは、1995 年から 2005 年頃までゲノムをシーケンシングするための最も先進的な技術でした。ショットガン戦略は現在でも適用されていますが、ショート リード シーケンシングやロング リード シーケンシングなどの他のシーケンシング技術が使用されています。

ショートリードまたは「次世代」シーケンシングでは、比較的短い時間（1日程度）で、短いリード（25～500bp）で数十万または数百万のリードが生成されます。^[18] これにより、高いカバレッジが得られますが、アセンブリプロセスははるかに計算集約的です。これらの技術は、データ量が多く、ゲノム全体のシーケンシングにかかる​​時間が比較的短いため、サンガーシーケンシングよりもはるかに優れています。^[19]

400～500塩基対の長さの読み取りがあれば、ゲノムがすでにわかっている場合、例えばk -merベースの 分類ソフトウェアを使用して、DNAの由来となる生物の種または株を特定するのに十分です。環境サンプルの次世代シーケンシングから得られる数百万の読み取りにより、腸内細菌叢のような何千もの種を含む複雑なマイクロバイオームの完全な概要を取得することができます。16S rRNAアンプリコンシーケンシングに対する利点は、細菌に限定されないこと、アンプリコンシーケンシングでは属のみを取得するのに対し、株レベルの分類が可能であること、遺伝子全体を抽出してメタゲノムの一部としてその機能を特定できることです。^{[20]メタゲノムシーケンシングの感度により}、臨床使用には魅力的な選択肢となっています。^[21]ただし、サンプルまたはシーケンシングパイプラインの汚染の問題が強調されています。^[22]

• 臨床メタゲノム配列解析
• DNA配列理論

 この記事には、NCBI ハンドブック (国立生物工学情報センター)のパブリック ドメイン資料が組み込まれています。