ウイルス不活化

ウイルス不活化とは、ウイルスを完全に除去するか、非感染性にすることで、サンプル中のウイルスが目的の製品を汚染するのを防ぐことです。これらの技術は、食品や血漿^[1]産業で広く使用されています。これらの製品はウイルス粒子の存在によって損傷を受ける可能性があるためです。これらの方法で除去される一般的なウイルスには、HIV-1およびHIV-2ウイルス、 A 型肝炎、B 型肝炎、C 型肝炎、パルボウイルスなどがあります。^{[2]これらの方法は、ウイルスとは関係のない}プリオンを血液製品から除去するために採用されています。^[3]

単にウイルス除去として知られるようになったこの包括的なプロセスでは、特定のサンプル内のすべてのウイルスが従来の抽出法または[フルエネルギー]法によって除去されます。より有名な方法には次のものがあります。

• ナノ濾過
• クロマトグラフィー

これらの抽出プロセスは、ウイルスに化学的に影響を及ぼすことはなく、単にサンプルからウイルスを物理的に除去するだけなので、「伝統的なプロセス」と見なされます。

ナノ濾過技術^[4]を使用したウイルス除去プロセスは、サイズ排除によってウイルスを特異的に除去します。このタイプのプロセスは、通常、パルボウイルス^[5]やタンパク質コートを含むその他のウイルスに使用されます。一般的な HIV ウイルス粒子は 180 nm で、一般的なパルボウイルスは 15 ～ 24 nm と非常に小さいです。極端な温度や酸性度を伴う方法と比較した場合、濾過の大きな利点の 1 つは、濾過によってサンプル内のタンパク質が変性しないことです。ナノ濾過は、ほとんどの種類のタンパク質にも効果的です。化学的に選択的ではないため、ウイルス粒子の表面化学がどのようなものであっても、ナノ濾過技術を使用したウイルス除去プロセスは依然として効果的です。この技術のもう 1 つの大きな利点は、ラボ規模で実行してから、生産基準まで効果的にスケールアップできることです。ただし、ウイルスの除去レベルはナノフィルターの細孔サイズに依存するという事実を考慮することが重要です。場合によっては、非常に小さなウイルスは濾過されません。圧力や流量の変化による影響も考慮する必要があります。

これらのタイプのプロセスを実行するために使用されるフィルターには、Planova 15N、^[6] Planova 20N、BioEX、VAG-300、Viresolve 180、^[7] Viresolve 70TM、およびVirosart ^[8]シリーズなどがあります。

ウイルスを除去するクロマトグラフィー法は、タンパク質の精製に最適で、あらゆる種類のウイルスに対しても有効ですが、ウイルス除去のレベルは、カラムの構成とプロセスで使用される試薬に依存します。このプロセスの有効性はウイルスによって大きく異なる可能性があり、使用するバッファーによって効率が変わる可能性があります。この手順を実行する場合、バッチ間の衛生も懸念事項となります。

膜クロマトグラフィーは、ウイルスの精製と除去にますます人気が高まっています。

ウイルス不活化により、ウイルスは感染できなくなります。多くのウイルスには、化学的変化によって不活化できる脂質またはタンパク質の殻があります。ウイルス不活化は、ウイルス除去とは異なります。前者のプロセスでは、ウイルスの表面化学が変化し、多くの場合、（感染性のない）ウイルス粒子が最終製品に残ります。ウイルスを単に不活化するのではなく、一部のウイルス不活化プロセスでは、ウイルスが完全に変性します。ウイルス不活化は、血漿産業やモノクローナル抗体ベースのバイオ医薬品の製造で広く使用されています。

サンプル内のウイルスを不活性化するには、何らかの方法でウイルスを化学的に変化させる「特別な」精製プロセスを実行する必要があります。最も広く使用されているプロセスのいくつかは次のとおりです。

• 溶剤/洗剤の不活性化
• 低温殺菌（加熱）
• 酸性pH不活性化

場合によっては、変性または不活性化されたウイルス粒子であってもプロセス ストリームまたは製品自体に有害な影響を及ぼす可能性があるため、ウイルスの不活性化は実行可能な除去方法ではありません。

ニューヨーク血液センター[ ^9] によって開発されたこのプロセスは、現在までで最も広く使用されているウイルス不活化方法です。主に血漿業界で使用されており、世界中の50を超える組織やアメリカ赤十字[1]によって使用されています。ただし、このプロセスは脂質コートでエンベロープされたウイルスにのみ有効です。この方法で使用される洗剤は、ウイルスの脂質コーティング内の分子間の相互作用を妨げます。ほとんどのエンベロープウイルスは脂質コーティングなしでは存在できないため、これらの洗剤にさらされると破壊されます。他のウイルスは破壊されない場合もありますが、増殖することができないため、非感染性になります。溶媒は、脂質コートと洗剤の間の凝集反応がより急速に起こる環境を作り出します。通常使用される洗剤はTriton X-100です。

このプロセスには、「従来の」除去技術の利点が数多くあります。洗剤は脂質と脂質誘導体にのみ作用するため、このプロセスではタンパク質が変性しません。このプロセスによって 100% のウイルス死滅が達成され、装置は比較的シンプルで使いやすいものです。後続のプロセス ストリームの汚染を防ぐために、ウイルス不活化後の物質を精製するように設計された装置が必要になります。

S/D 処理では、入手しやすく比較的安価な試薬を使用しますが、これらの試薬は流通前に製品から除去する必要があり、追加のプロセス手順が必要になります。このプロセスではウイルスの脂質コーティングを除去/不活性化するため、脂質エンベロープのないウイルスは影響を受けません。また、このプロセスで使用されるバッファーによる不活性化効果もありません。

保護しようとしているタンパク質が、溶液中に存在するウイルス不純物よりも耐熱性が高い場合、低温殺菌によるウイルスの不活化は非常に効果的です。この種のプロセスの最も顕著な利点のいくつかは、必要な装置が単純であることと、エンベロープを持つウイルスと持たないウイルスの両方に効果的であることです。低温殺菌では、ウイルスを十分に変性させる値まで溶液の温度を上げるため、エンベロープだけではそのような高温からウイルスを保護することができないため、ウイルスにエンベロープがあるかどうかは問題ではありません。ただし、ウイルスの熱安定剤として機能することがわかっているタンパク質がいくつかあります。もちろん、標的タンパク質が耐熱性でない場合、この技術を使用すると、標的タンパク質とウイルス不純物が変性する可能性があります。通常のインキュベーションは10時間続き、60° Cで実行されます。

一部のウイルスは、低pHにさらされると自然に変性します。低温殺菌と同様に、このウイルス不活化技術は、標的タンパク質がウイルス不純物よりも低 pH に耐性がある場合に有効です。この技術はエンベロープウイルスに対して有効で、通常使用される装置はシンプルで操作が簡単です。ただし、このタイプの不活化方法は、エンベロープを持たないウイルスにはそれほど効果的ではなく、高温も必要です。したがって、この方法を使用するには、標的タンパク質が低 pH と高温に耐性を持っている必要がありますが、残念ながら多くの生物学的タンパク質ではそうではありません。このプロセスの培養は通常、pH 4 で行われ、6 時間から 21 日間続きます。

酸性不活化は、モノクローナル抗体ベースのバイオ医薬品の製造プロセスで一般的に使用されています。このプロセスは、pHを3.6付近またはそれ以下に下げ、室温で少なくとも30分間インキュベートすることから構成されます。^[10]

紫外線は核酸二量体を形成して生物の DNA に損傷を与える可能性があります。しかし、紫外線は生体組織を透過しにくいため、通常、損傷は重大ではありません。しかし、ウイルス粒子は小さく、紫外線は遺伝物質に到達して核酸の二量体化を誘発するため、紫外線を使用してウイルスを不活性化することができます。DNA が二量体化すると、ウイルス粒子は遺伝物質を複製できなくなり、拡散できなくなります。

紫外線とリボフラビンの組み合わせは、輸血製品中の病原体を減らすのに効果的であることが示されています。^{[11] [12]} リボフラビンと紫外線は、ウイルス、細菌、寄生虫、ドナーの白血球の核酸を損傷し、それらが複製して病気を引き起こすことを不可能にします。^{[13] [14] [15]}

多くの場合、特定のサンプル内のウイルスの濃度は極めて低いです。他の抽出プロセスでは、低レベルの不純物は無視できるかもしれませんが、ウイルスは感染性の不純物であるため、ウイルス粒子が 1 つでもプロセス チェーン全体を台無しにする可能性があります。このため、どのような種類の溶液からどのような種類のウイルスを抽出する場合でも、適切な除去または不活性化方法を決定するために特別な対策を講じる必要があります。

スパイク研究は、この目的のために特別に作成されました。スパイク研究は、ウイルスの除去または不活性化の可能な方法を決定するために行われる研究です。これらの研究の結果は数値化されており、研究者はこれらの数値に基づいて、研究を実施したプロセスが、抽出しようとしているウイルスと、ウイルスを抽出しようとしている溶液に適しているかどうかを判断できます。

実験により、サンプルのウイルス数 (または活性レベル) を元の 10 ^{4 倍}または 10 ⁵倍に増やしても、ウイルス除去/不活性化率は 1 桁しか変わらないことがわかっています [参考文献?]。この知識から、スパイク研究が考案されました。スパイク研究では、ウイルス数 (または活性レベル) を元のサンプルの 10 ^{4 倍}または 10 ⁵倍に増やす (または「スパイク」する) というものです。この新しい高い数または活性レベルは、プロセス ストリームに通されて精製されます。この数または活性レベルは、プロセス ストリームの最初と最後に取得され、削減係数の計算に使用されます。

ウイルス除去または不活化ステップの減少係数（RF）は、次の式を使用して計算されます。^[16]

RF_ステップ= log ₁₀ [(V1 x T1)/(V2 x T2)]

ここで、V1 = クリアランスステップ前の添加原料の体積、T1 = クリアランスステップ前の添加原料のウイルス濃度、V2 = クリアランスステップ後の物質の体積、T2 = クリアランスステップ後の物質のウイルス濃度。

特定のプロセス ストリームに必要な削減係数は、さまざまな要因に依存しますが、その一部を以下に示します。

• ウイルスの予想される初期濃度
• 精製される製品
• ウイルスの感染量（生体内使用の場合）
• 不活性化が完全除去の実行可能な代替手段であるかどうか
• 研究室の能力
• 不活性化または除去方法の相対的な難しさ

この技術は食品および医薬品業界で広く使用されていますが、ウイルス処理のその他の用途には次のようなものがあります。

• 空気清浄機（ミリポア）^[17]
• ワクチン
• ウイルスサンプルの抽出
• 浄水
• ウエストナイルウイルスの不活化