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ショ糖ギャップ法は、神経線維や筋線維に伝導ブロックを作成するために使用されます。高濃度のショ糖を細胞外空間に塗布すると、ナトリウムチャネルとカリウムチャネルの正しい開閉が妨げられ、2つの細胞群間の抵抗が増加します。この方法はもともとロバート・シュテンフリが神経線維の活動電位を記録するために開発したもので、[1]未処理の膜領域をショ糖領域間のノードに引き込むことができるため、チャネル特性の不可逆的または非常に変動の大きい薬理学的変化を測定するのに特に役立ちます。[2]
歴史
スクロースギャップ法は、 1947年から1949年にかけてアラン・ホジキン、アンドリュー・ハクスリーと共同研究を行ったロバート・シュテンフリによって1954年に初めて導入されました[3]。シュテンフリは研究から、神経線維に沿って移動する電流は、細胞外の伝導媒体の量を減らす高抵抗のギャップがあると、より簡単に測定できることを突き止めました。シュテンフリは、当時膜電位を測定するために使用されていた方法に多くの問題があることに気づきました。彼はスクロースギャップと名付けた新しい方法を実験しました。この方法は、神経線維の活動電位の研究に使用されました[3]。
ハクスリーはシュテンフリの方法を観察し、それが有用であり、ほとんどエラーを生じないことに同意した。スクロースギャップ法は、シュテンフリとハクスリーの抑制性接合電位の発見にも貢献した。[4]導入以来、この技術には多くの改良と変更が加えられてきた。単一スクロースギャップ法の1つの修正は、1987年にCHVホイルによって導入された。[5] 1968年にルージェ、ヴァソート、シュテンフリによって心臓細胞の研究に初めて使用された二重スクロースギャップ法は、C.レオティとJ.アリックスによって改良され、彼らは電圧クランプ法 による二重スクロースギャップ用の改良チャンバーを導入し、ノードからの外部抵抗を排除した。[6]
方法
古典的なスクロースギャップ法は、通常、研究対象のニューロンまたは細胞の各セグメントを含む 3 つのチャンバーで構成されます。テストチャンバーには、細胞の自然環境のイオン濃度と浸透圧を模倣したクレブス溶液やリンゲル液などの生理学的溶液が含まれています。また、このチャンバーにテスト薬剤を追加して、細胞機能への影響を調べることもできます。テスト溶液内の細胞を刺激するには、通常、Ag-AgCl または白金線電極が使用されます。スクロースチャンバー (またはギャップ) は、他の 2 つのチャンバー、つまり神経線維または細胞のセクションを分離する中央のチャンバーです。このチャンバーには、高比抵抗の等張スクロース 溶液が含まれています。比抵抗は、電流に抵抗する材料または溶液の能力を表すため、高比抵抗のスクロース溶液は、3 つのチャンバーを電気的に分離するのに効果的です。3 番目のチャンバーには通常、細胞内溶液を模倣した KCl 溶液が含まれています。このチャンバー内の高濃度カリウムは組織の浸漬部分を脱分極させ、ショ糖ギャップで隔てられた2つの部分間の電位差を測定できるようにします。神経または組織を所定の位置に密封し、チャンバー間の溶液の拡散を防ぐために、ワセリン、シリコングリース、またはシリコンワセリン混合物が使用されます。膜電位の変化を記録するために、寒天で架橋された一対のAg-AgCl電極がテストチャンバーとKClチャンバーに配置されます。[7]
シングルスクロースギャップ法
単一ショ糖ギャップ法は、細胞の電気的活動を研究するために使用されます。これは、小さな神経線維や平滑筋細胞などの電気的に接続された細胞の研究に役立ちます。この方法では、 2 つの細胞群の間に高抵抗のギャップを導入することで、神経または筋線維に伝導ブロックを作成します。非イオン性ショ糖溶液を使用して、2 つの細胞群間の細胞外領域の抵抗を増加させます。[8]これにより、ギャップの片側で発生したすべての電流が、神経または組織の内部のみを通って反対側に流れます。2 つのグループ間の相対的な電位の変化を測定し、記録することができます。[7]
ダブルスクロースギャップ法
シングルスクロースギャップ法には改良が加えられてきました。その 1 つがダブルスクロースギャップ法です。これは、抵抗と膜電位を同時に測定するために使用されます。スクロース溶液が入った 2 つのチャンバーを使用して、生理学的溶液に浸された神経または組織のノードを分離します。神経または組織の両端は、カリウムイオンが豊富な溶液によって脱分極されます。ノード、つまりテストチャンバーとカリウムが豊富なチャンバーの 1 つとの間の電位差を測定できます。一方、ノードの電位は、カリウムが豊富なもう 1 つのチャンバーとノードとの間で発生する電流によって変更できます。得られた情報は、オームの法則の式とともに、ノード内の細胞の膜抵抗を決定するために使用できます。[8]ダブルスクロースギャップは、電圧クランプとしても使用できます。[9]適切な電子機器と併用すると、ダブルスクロースギャップを使用して、テストチャンバーに含まれる神経または組織セグメントの膜電位を電圧クランプできます。[8]
利点と限界
利点
ショ糖ギャップ法では、多細胞組織におけるイオン電流の測定が可能です。ニューロンの機能の研究には電圧クランプ法やパッチクランプ法も有効ですが、ショ糖ギャップ法の方が実行しやすく、費用もかかりません。さらに、ショ糖ギャップ法では、神経線維や平滑筋細胞などの小さな細胞から長期間にわたって安定した記録を得ることができます。ただし、細胞内電極やパッチクランプ電極では、小さな軸索や細胞を物理的に損傷する可能性があるため、同様の測定を行うのは非常に複雑です。ショ糖ギャップチャンバーの配置により、ニューロンや細胞を刺激する手法はシンプルで信頼性があります。この方法は、試験チャンバーに導入できるさまざまな薬理学的に活性な薬剤に対する膜電位の変化を研究するのにも役立ちます。 [7]
制限事項
シングルスクロースギャップの主な制限は、膜電位と活動電位の振幅の実際の値を決定できないことです。シャント効果のため、スクロース溶液で分離された領域間の電位の相対的な変化しか測定できません。ただし、ダブルスクロースギャップでは、膜電位と抵抗を測定できます。もう 1 つの制限は、細胞間に電気的結合がない組織 (つまり、空間定数 λ がゼロに近い場合) から膜電位を取得できないことです。[7]また、イオン濃度の低いスクロース溶液は、露出した細胞からナトリウムやカリウムなどの重要な細胞内イオンを枯渇させ、細胞の生存率に影響を与える可能性があります。[8]これにより、膜が過分極し、細胞に沿った活動電位の伝導に影響を与える可能性があります。これらの制限にもかかわらず、スクロースギャップ法には多くの利点があり、神経科学研究において有用で信頼性の高い手法となっています。[7]
アプリケーション
ショ糖ギャップ法は、有髄神経、無髄神経、平滑筋、心筋の膜活動を記録するのに用いられる。微小電極法やパッチクランプ法とともに、ショ糖ギャップ法は神経系の研究によく用いられ、薬物が膜活動に及ぼす影響を調べるのに効果的な方法となりうる。[7]ウサギの上頸神経節の静止電位に対するコリン、アセチルコリン、カルバコールの影響に関する研究は、ショ糖ギャップ法を用いて行われた。上頸神経節の膜電位の記録は、神経節と内頸神経の脱分極を分離できるため、ショ糖ギャップ法によって簡単に行える。[10]
ショ糖ギャップ法は、モルモットの尿管を用いて、外部カリウム濃度と平滑筋細胞の膜電位の関係を決定するために適用されている。 [11]また、膜を通した漏れ電流と細胞外抵抗から生じる不正確な膜電位測定を修正するためにも使用されている。ショ糖ギャップ法を利用することで、不正確な膜電流測定値を修正することもできる。[12]
ショ糖ギャップ法の発展により、二重ショ糖ギャップ法が生まれました。二重ショ糖ギャップ法は、一般的に、単一ショ糖ギャップ法では不可能な小さな神経線維セグメントを電気的に分離するのに有利です。 [11]羊や子牛の心室筋線維の膜電位と電流の研究で行われました。[13]二重ショ糖ギャップ法は、心筋の研究でも単一ショ糖ギャップ法よりも利用されており、脱分極の最初の10～100ミリ秒以内に発生する初期電流をより明確に解析できます。[11]
参考文献
- ^ Stämpfli, R (1954). 「外部電極を用いた膜電位測定の新手法」. Experientia . 10 (12): 508–509. doi :10.1007/BF02166189. PMID 14353097. S2CID 41384989.
- ^ Pooler, JP; Valenzeno, DP. (1983). 「ロブスターの巨大軸索の研究のための二重スクロースギャップ法の再検討。理論と実験」。Biophys J. 44 ( 2): 261–269. Bibcode :1983BpJ....44..261P. doi :10.1016/S0006-3495(83)84298-2. PMC 1434829. PMID 6652217 .
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