核オーバーハウザー効果

核オーバーハウザー効果（NOE）とは、スピン活性核（例えば、^¹H、^¹³C、^¹⁵Nなど）の一方の集団から他方の集団へ、交差緩和を介して核スピン偏極が伝達される現象である。核磁気共鳴分光法（NMR）におけるNOEの現象論的定義は、 RF磁場照射によって飽和した別のNMR共鳴の積分強度（正または負）の変化である。核の共鳴強度の変化は、その核がRF摂動によって直接影響を受ける核と空間的に近接していることの結果である。

NOEは、NMR共鳴の帰属、および有機分子や生体分子の構造や配置の解明と確認において特に重要です。1H^二次元NOE分光法（NOESY）実験とその拡張は、溶液中のタンパク質やその他の生体分子の立体化学を特定するための重要なツールですが、固体状態では、立体化学を特定するために通常、結晶X線回折が使用されます。^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]}異核NOEは、^13C NMR分光法において、プロトンに結合した炭素を特定し、そのような炭素に分極増強を与えて信号対雑音比を高め、これらの炭素の緩和が双極子-双極子緩和機構によってどの程度制御されているかを確認するために特に重要です。^{[ 4 ]}

NOEは、1953年に特定の金属の伝導電子にマイクロ波を照射することで核スピン偏極が増強される可能性があると提唱したアメリカの物理学者アルバート・オーバーハウザーの理論的研究から発展した。 ^{[ 5 ]} オーバーハウザーが予測した電子核増強は、同じく1953年にTRカーバーとCPスリヒターによって^{7Li金属で実験的に実証された。 [ 6 ]} HF分子の核スピンのみに関わるオーバーハウザー効果の一般的な理論的基礎と実験的観測は、 1955年にイオネル・ソロモンによって発表された。 ^{[ 7 ]} NOEのもう1つの初期の実験的観測は、1963年にカイザーによって、NOEがスカラー結合定数 の相対的な符号を決定し、NMRスペクトルのスペクトル線をエネルギー準位間の遷移に割り当てるためにどのように使用できるかを示すために使用された。この研究では、同じ有機分子内の別のプロトン集団がRF照射によって飽和されると、有機分子内の1つのプロトン集団（ ^{1H ）の共鳴が増強された。 [ 8 ]} NOEの応用は、1965年にAnetとBournによってβ , β-ジメチルアクリル酸とジメチルホルムアミドのNMR共鳴の帰属を確認するために使用され、それによって溶液中の有機分子のコンフォメーションと配置情報が得られることが示された。^{[ 9 ]} BellとSaundersは1970年にNOE増強と核間距離の間に直接相関があることを報告した^{[ 10 ]} 一方、3つ以上のスピンを持つ分子の核間距離の定量的測定はSchirmerらによって報告された。^{[ 11 ]}

リチャード・R・エルンストは、フーリエ変換および二次元NMR分光法の開発により1991年のノーベル化学賞を受賞し、この方法はすぐに特に大きな生体分子におけるNOEの測定に応用されました。^{[ 12 ]} 2002年、クルト・ヴュートリッヒは、溶液中の生体高分子の三次元構造を決定するための核磁気共鳴分光法の開発によりノーベル化学賞を受賞し、2D NOE法（NOESY）を使用して大きな生体高分子の三次元構造を制約できることを示しました。^{[ 13 ]}アニル・クマール教授は、二次元核オーバーハウザー効果（2D-NOE、現在はNOESYとして知られる）実験を生体分子に初めて適用し、NMR分光法による溶液中の生体分子の三次元構造の決定の分野を開拓しました。^{[ 14 ]}

NOEと核スピン格子緩和は密接に関連した現象です。磁場中の単一のスピン1/2核には、αとβというラベルが付けられる2つのエネルギー準位があり、それぞれ+1/2と-1/2という2つの可能なスピン量子状態に対応します_。熱平衡状態では、 2つのエネルギー準位の占有率は、スピン占有率がPαとPβで与えられるボルツマン分布によって決定されます。_遷移エネルギー周波数で適切なRF磁場によってスピン占有率が摂動されると、スピン占有率はスピン格子緩和と呼ばれるプロセスによって熱平衡状態に戻ります。αからβへの遷移率は、状態αの占有率Pαに比例し_、速度定数Wの一次プロセスです。連続的なRF照射によってスピン集団が均一化される状態（Pα = Pβ ）は飽和と呼ばれ、遷移確率_はエネルギー準位間の集団差に依存するため、共鳴は消失する_。

NOEが関係する最も単純なケースでは、2つのスピン1/2核IとSの共鳴は化学的にシフトしているが、J結合はしていない。このようなシステムのエネルギー図には、IとSのスピン状態に応じて、それぞれαα、αβ、βα、ββに対応する4つのエネルギー準位がある。Wは、4つのエネルギー準位間で遷移が発生する単位時間あたりの確率、言い換えれば、対応するスピン反転が発生する速度である。αα➞βαとαβ➞ββに対応する2つの単一量子遷移W1I 、^αα➞αβとβα➞ββに対応するW1S、βα➞αβに対応するゼロ量子遷移_{W0 、および}αα➞ββに対応する二重量子遷移がある^。

高周波照射は（いわゆる量子力学的選択則により）単一量子遷移のみを誘起し、観測可能なスペクトル線を生じさせるが、双極子緩和はどの経路でも起こり得る。双極子機構は、複数のスピン反転を伴う遷移を引き起こすことができる唯一の一般的な緩和機構である。具体的には、双極子緩和機構は、αα状態とββ状態の間（W ₂）およびαβ状態とβα状態の間（W ₀）の遷移を生じさせる。

バルクNMR磁化の観点から表現すると、核Sの共鳴が飽和したときの核Iの実験的に観測された定常状態NOEは（${\displaystyle M_{S}=0}$）は、次の式で定義されます。

${\displaystyle \eta _{I}^{S}=\left({\frac {M_{I}^{S}-M_{0I}}{M_{0I}}}\right)}$

どこ${\displaystyle M_{0I}}$原子核の磁化（共鳴強度）${\displaystyle I}$熱平衡状態において、NOEの解析的表現は、すべての緩和経路を考慮し、ソロモン方程式を適用することによって得られる。

${\displaystyle \eta _{I}^{S}={\frac {M_{I}^{S}-M_{0I}}{M_{0I}}}={\frac {\gamma _{S}}{\gamma _{I}}}{\frac {\sigma _{IS}}{\rho _{I}}}={\frac {\gamma _{S}}{\gamma _{I}}}\left({\frac {W_{2}-W_{0}}{2W_{1}^{I}+W_{0}+W_{2}}}\right)}$

どこ

${\displaystyle \rho _{I}=2W_{1}^{I}+W_{0}+W_{2}}$そして${\displaystyle \sigma _{IS}=W_{2}-W_{0}}$。

$\displaystyle \rho _{I}}$は全縦方向双極子緩和率（$1/T_1$スピンsの存在によるスピンIの ) 、$\displaystyle \sigma _{IS}}$これは交差緩和速度と呼ばれ、$\displaystyle \gamma _{I}}$そして$\displaystyle \gamma _{S}}$磁気回転比は${\displaystyle I}$そして${\displaystyle S}$それぞれ原子核。

縮退したW ₁ ^S遷移の飽和は平衡分布を乱し、P _αα = P _αβおよびP _βα = P _ββとなる。しかし、システムの緩和経路は活性のままであり、平衡を再確立する働きをする。ただし、W ₁ ^S遷移は無関係である。なぜなら、これらの遷移間の分布差は RF 照射によって固定され、 W _I遷移間の分布差は平衡値から変化しないからである。これは、単一量子遷移のみが緩和経路として活性である場合、${\displaystyle S}$共鳴は強度に影響を与えない${\displaystyle I}$共鳴。したがって、I の共鳴強度に NOE を観測するには、${\displaystyle W_{0}}$そして${\displaystyle W_{2}}$が重要であるはずです。クロス緩和経路として知られるこれらの経路は、緩和が双極子-双極子またはスカラー結合相互作用によって支配されている場合にのみ、スピン格子緩和に大きく寄与しますが、スカラー相互作用はめったに重要ではなく、無視できると想定されます。同核の場合、${\displaystyle \gamma _{I}=\gamma _{S}}$、 もし${\displaystyle W_{2}}$が主要な緩和経路であり、飽和する${\displaystyle S}$強度を高める${\displaystyle I}$共鳴し、NOEは正であるが、${\displaystyle W_{0}}$は、飽和する主要な緩和経路です。${\displaystyle S}$強度を低下させる${\displaystyle I}$共鳴が起こり、NOEは負の値になります。

NOEが正か負かは、回転分子運動の程度に大きく依存する。^{[ 3 ]} _{3つの双極子緩和経路は、多くの要因に応じてスピン格子緩和に異なる程度で寄与する。重要な要因の1つは、ω 2}、ω ₁、ω ₀のバランスが分子回転相関時間に大きく依存することである。$\displaystyle \tau _{c}}$分子が1ラジアン回転するのにかかる時間。NMR理論によれば、遷移確率は$\displaystyle \tau _{c}}$そしてラーモア歳差運動の周波数は、${\displaystyle \omega }$関係性によって：

${\displaystyle W_{1}^{I}\propto {\frac {3\tau _{c}}{(1+\omega _{I}^{2}\tau _{c}^{2})}}{\frac {1}{r^{6}}}}$

${\displaystyle W_{0}\propto {\frac {2\tau _{c}}{(1+(\omega _{I}-\omega _{S})^{2}\tau _{c}^{2})}}{\frac {1}{r^{6}}}}$

${\displaystyle W_{2}\propto {\frac {12\tau _{c}}{(1+(\omega _{I}+\omega _{S})^{2}\tau _{c}^{2})}}{\frac {1}{r^{6}}}}$

どこ${\displaystyle r}$は、 2つのスピン1/2原子核を隔てる距離です。緩和が起こるためには、分子の回転運動の周波数が原子核のラーモア周波数と一致する必要があります。流動性溶媒中では、分子の回転運動は よりもはるかに速いです。${\displaystyle \omega }$いわゆる極限狭窄限界では${\displaystyle \omega \tau _{c}\ll 1}$) これらの条件下では、τ _cと 2ω _{0 が}τ _cと ω ₁よりもよく一致するため、二重量子緩和 W _{2は W 1}または W ₀よりも効果的です。ω ₂が支配的な緩和プロセスである場合、正の NOE が発生します。

${\displaystyle W_{1}^{I}\propto \gamma _{I}^{2}\gamma _{S}^{2}{\frac {3\tau _{c}}{r^{6}}}}$

${\displaystyle W_{0}\propto \gamma _{I}^{2}\gamma _{S}^{2}{\frac {2\tau _{c}}{r^{6}}}}$

${\displaystyle W_{2}\propto \gamma _{I}^{2}\gamma _{S}^{2}{\frac {12\tau _{c}}{r^{6}}}}$

${\displaystyle \eta _{I}^{S}(max)={\frac {\gamma _{S}}{\gamma _{I}}}\left[{\frac {{\frac {12\tau _{c}}{r^{6}}}-{\frac {2\tau _{c}}{r^{6}}}}{{\frac {2\tau _{c}}{r^{6}}}+2{\frac {3\tau _{c}}{r^{6}}}+{\frac {12\tau _{c}}{r^{6}}}}}\right]={\frac {\gamma _{S}}{\gamma _{I}}}\left[{\frac {12-2}{2+6+12}}\right]={\frac {\gamma _{S}}{\gamma _{I}}}{\frac {1}{2}}}$

この式は、同核の場合（特に¹ H NMR の場合）、観測できる最大の NOE は核の近接度に関係なく 1/2 であることを示しています。異核の場合（I ≠ S）、最大の NOE は 1/2 ( γ _S / γ _I ) で与えられ、広帯域プロトンデカップリングの条件下で異核を観測すると、感度が大幅に向上する可能性があります。有機化学で最も重要な例は、^{1 H をデカップリングしながら13} Cを観測することです。これは^{1 J 共鳴も飽和させます。γ} S / γ _Iの値は4 に近く、NOE の最大増強率は 200% となり_、 NOE がない場合よりも 3 倍強い共鳴が得られます。^{[ 15 ]}多くの場合、炭素原子にはプロトンが結合しており、これにより緩和は双極子緩和によって支配され、NOE はほぼ最大になります。プロトン化されていない炭素原子の場合、NOE増強は小さいですが、双極子-双極子相互作用以外の緩和機構で緩和する炭素の場合、NOE増強は大幅に減少する可能性があります。これが、13C NMRで重水素化溶媒（CDCl3など）を使用する動機の1つです^。_重水素は四極子機構で緩和するため、交差緩和経路はなく、NOEは存在しません。もう1つの重要なケースは、磁気回転比の値が負である^15Nの例です。1H^{核がデカップリングされている場合、 15N}共鳴は減少するか、NOEによって共鳴が実際に相殺されることがよくあります。負のNOEを最小限に抑えるために、プロトンから^15Nへの分極移動を伴うパルス技術を使用してこのようなスペクトルを取得することが通常有利です。

定常状態の NOE と核間距離の関係は、緩和速度や分子運動によって複雑ですが、多くの場合、極限的に狭まる小さな高速回転分子の場合、正の NOE の半定量的性質は、J 結合定数の測定と組み合わせて、多くの構造的応用において有用です。たとえば、NOE 増強は、NMR 共鳴割り当ての確認、構造異性体の区別、芳香環置換パターンと脂肪族置換基配置の特定、および配座の好みの決定に使用できます。^{[ 3 ]}

観測された NOE から得られる原子間距離は、分子の三次元構造を確認するのに役立つことが多い。^{[ 3 ] [ 15 ]}この応用では、NOE は化学結合ではなく空間を介して発生するという点で、 J 結合の応用とは異なります。したがって、互いに空間的に近接している原子は、それらを隔てる化学結合の数に関係なく NOE を与えることができますが、スピン結合は原子が 1 ～ 3 個の化学結合で接続されている場合にのみ観測されます。しかし、関係η _I ^S (max) = 1 / 2は、緩和が 2 つの原子核 I と S の間の双極子-双極子相互作用によって 100% 支配される理想的なケースにのみ適用されるため、NOE が核間距離とどのように関連しているかを不明瞭にします。実際には、ρ _{Iの値には、} W ₁を増加させることによってW ₀とW ₂の影響を減らすだけの他の競合するメカニズムからの寄与が含まれています。例えば、溶媒中の溶存酸素や常磁性金属イオン不純物との電子核相互作用による緩和によって、弱いNOE増強の観測が妨げられる場合がある。他の緩和機構が存在する場合の観測NOEは次式で表される。

${\displaystyle \eta _{I}={\frac {\sigma _{IS}}{\rho _{I}+\rho ^{*}}}}$

ここで、ρ ^⋇は、交差緩和を伴わない緩和機構による全緩和速度への追加的な寄与である。極限狭窄における双極子緩和に同じ理想化された2スピンモデルを用いると、次のようになる。

${\displaystyle \rho _{I}\propto {\frac {\tau _{c}}{r^{6}}}}$

^{[ 15 ]}は簡単に示せる。

$\displaystyle \eta _{I}^{S}\propto \left({\frac {\tau _{c}}{\rho ^{*}}}\right){\frac {1}{r^{6}}}}$

したがって、2スピン定常状態NOEは、外部緩和からの寄与がある場合にのみ核間距離に依存します。BellとSaundersは、厳密な仮定に従うと、ρ ^⋇ / τ _{c は}極限狭窄の極限で類似分子に対してほぼ一定であることを示しました。^{[ 10 ]} したがって、定常状態NOE値の比率を取ると、核間距離rの相対値が得られます。定常状態実験は多くの場合に有用ですが、相対的な核間距離に関する情報しか提供できません。一方、NOEが成長する初期速度はr _IS ⁻⁶に比例し、2D-NOESYなどの過渡実験を介して構造情報を取得するためのより洗練された代替手段を提供します。

NOEの測定に2次元NMRを使用する動機は、他の2次元法と同様です。影響を受ける共鳴を2次元に広げることで最大分解能が向上し、より多くのピークが分解され、より大きな分子を観測でき、1回の測定でより多くのNOEを観測できます。さらに重要なことに、分子運動が中間または低速運動領域にある場合、NOEはゼロまたは負の値となり、定常状態NOE実験では核間距離に関連付ける結果が得られません。^{[ 3 ]}

核オーバーハウザー効果分光法（NOESY）は、交差緩和を起こしている核スピンを同定し、その交差緩和速度を測定するために使用される2次元NMR分光法です。溶液中の有機分子では、 ^1H双極子-双極子結合が交差緩和の主要な手段となるため、交差緩和を起こしているスピンは空間的に互いに近い位置にあるスピンです。したがって、NOESYスペクトルのクロスピークは、どのプロトンが空間的に互いに近い位置にあるかを示します。この点で、NOESY実験は、J結合を利用してスピン-スピン相関を提供するCOSY実験とは異なります。COSY実験のクロスピークは、分子の化学結合を介してどの^{1Hが他のどの1H}に近い位置にあるかを示します。

基本的な NOESY シーケンスは 3 つの 90° パルスで構成されます。最初のパルスは横方向のスピン磁化を生成します。スピンは進化時間 t ₁の間歳差運動し、この時間は 2D 実験の過程で増加します。2 番目のパルスは、パルスの方向に直交する横方向の磁化成分に等しい縦方向の磁化を生成します。したがって、このアイデアは混合期間τ _mの初期条件を生成することです。NOE 混合時間中、交差緩和による磁化移動が起こり得ます。基本的な NOESY 実験では、τ _{m は}2D 実験全体を通して一定に保たれますが、最適な交差緩和速度と NOE の蓄積のために選択されます。3 番目のパルスは、残りの縦方向の磁化から横方向の磁化を生成します。データ取得は 3 番目のパルスの直後に開始され、横方向の磁化はパルス遅延時間 t _{2の関数として観測されます。NOESY スペクトルは、t 1}と t ₂に関する 2D フーリエ変換によって生成されます。混合時間を徐々に長くして一連の実験を行い、NOE増強の増加を追跡した。最も近いプロトンほど、NOEの増強速度が最も速いことがわかった。

明確に割り当てられた、分解能が高く、信号対雑音比の高い NOESY スペクトルから、クロスピーク強度の解析によってプロトン間距離を決定できます。これらは体積積分によって得られ、プロトン間距離の推定値に変換できます。2 つの原子間の距離${\displaystyle i}$そして${\displaystyle j}$クロスピークボリュームから計算できる${\displaystyle V}$およびスケーリング定数${\displaystyle c}$

${\displaystyle r_{\text{NOE}}=\left({\frac {c}{V_{ij}}}\right)^{1/6}}$

どこ${\displaystyle c}$既知の固定距離の測定に基づいて決定できます。距離の範囲は、スペクトル内の既知の距離と体積に基づいて報告でき、平均が得られます。${\displaystyle c}$標準偏差${\displaystyle c_{SD}}$NOESYスペクトルの複数の領域を測定したところ、ピークは見られず、ノイズも検出されなかった。${\displaystyle V_{\rm {err}}}$測定誤差${\displaystyle m_{v}}$パラメータ${\displaystyle x}$は、既知の距離がすべて誤差範囲内に収まるように設定されています。これは、NOESY ボリュームの下限が

${\displaystyle r_{\text{NOE lower}}=\left({\frac {c-xc_{SD}}{{\frac {1}{m_{v}}}V_{ij}+V_{\rm {err}}}}\right)^{1/6}}$

そして上限は

${\displaystyle r_{\text{NOE higher}}=\left({\frac {c+xc_{SD}}{{\frac {1}{m_{v}}}V_{ij}-V_{\rm {err}}}}\right)^{1/6}}$

このような固定距離は、研究対象のシステムによって異なります。たとえば、ロックド核酸には、糖部分で距離がほとんど変化しない原子が多数存在するため、グリコシド結合のねじれ角を推定することができ、NMR を用いて LNA 分子動力学予測のベンチマークを行うことができました。^{[ 16 ]} しかし、RNA は、構造的に非常に柔軟な糖部分を持つため、下限値と上限値の推定範囲が広くなります。^{[ 17 ]}

タンパク質の構造解析では、NOE は分子内距離に制約を与えるために使用されます。この方法では、各プロトン対を個別に考慮し、NOESY クロスピーク強度を、ジェミナルメチレンプロトン対や芳香環プロトンなどの固定距離のプロトン対からの参照クロスピークと比較します。この単純なアプローチは、スピン拡散や不均一な相関時間の影響に対して比較的鈍感であり、十分な数の NOE が特定されていれば、通常はタンパク質の全体的なフォールドの定義につながります。NOESY クロスピークは、強い、中程度、弱いに分類でき、それぞれ約 2.5、3.5、5.0 Å の上限距離制約に変換できます。このような制約は、分子力学最適化で使用して、タンパク質の溶液状態のコンフォメーションの図を提供できます。^{[ 18 ]} 完全な構造決定は、化学シフトと NOESY 制約の両方を利用するさまざまな NMR 実験と最適化方法に依存しています。

NOEを利用した1次元および2次元NMR実験技術の例としては、以下のようなものがある。

• NOESY（核オーバーハウザー効果分光法）
• HOESY（ヘテロ核オーバーハウザー効果分光法）
• ROESY（回転フレーム核オーバーハウザー効果分光法）
• TRNOE（伝達型核オーバーハウザー効果）
• DPFGSE-NOE、二重パルス磁場勾配スピンエコーNOE実験

NOESY は、例えばタンパク質やその他の大きな生体分子などの分子内の原子の相対的な配向を決定し、三次元構造を生成するものです。 HOESY は、異なる元素の原子間の NOESY 相互相関です。 ROESY は、磁化がゼロにならないようにスピンロックするものであり、通常の NOESY が適用できない分子に適用されます。 TRNOE は、リガンドがタンパク質に結合する場合のように、同じ溶液中で相互作用する 2 つの異なる分子間の NOE を測定します。^{[ 19 ]} DPFGSE-NOE 実験では、強い信号を抑制して非常に小さな NOE を検出できる過渡的な実験が行われます。

図（上）は、核オーバーハウザー効果分光法がスイッチング可能な化合物の構造をどのように解明できるかを示しています。この例では、^{[ 20 ]} {H} と指定されたプロトンは、スイッチング可能なアゾ基の異性化状態（シスまたはトランス）に応じて、2 組の異なる NOE を示します。トランス状態では、プロトン {H} はフェニル基から遠く離れており、青色の NOE を示します。一方、シス状態では、プロトン {H} はフェニル基の近くにあり、新しい NOE が現れます（赤色で表示）。

NOEが共鳴の割り当てや立体配置の決定に役立つ別の例（下図）は多糖類です。例えば、複雑なグルカンは、特にプロトンスペクトルにおいて、多数の重なり合った信号を持っています。そのため、信号の割り当てにはNOESYを含む2D NMR実験を利用することが有利です。例えば、炭水化物のNOEを参照してください。

過去数十年にわたり、2D-NOESYは分子の構造解明のための貴重なツールへと発展してきた。2D-NOESYは小分子だけでなく、より大きな分子にも適用可能である。^{[ 21 ]}しかし、NOESYは単独で行われるものではなく、常に理論的な分子アンサンブルの生成と組み合わされ、NAMFISなどの助けを借りてデコンボリューションを行う必要がある。^{[ 22 ]}

• ハンス・J・ライヒ：核オーバーハウザー効果
• ユージン・E・クワン：講義12：核オーバーハウザー効果
• Beat Vögeli (2015). 「NMR構造およびダイナミクス解析における核オーバーハウザー効果」(PDF)。 2022年3月8日にオリジナル(PDF)からアーカイブされました。
• ウィリアムズ、マーティン、ロヴニャク著、第2巻：RRギル、A.ナバロ＝バスケス：第1章 核オーバーハウザー効果の天然物構造解明への応用
• ジェームズ・キーラー：8 リラクゼーション
• YouTube: ジェームズ・キーラー、講義10、リラクゼーションII。2013年ケンブリッジ大学NOE講演
• アーサー・G・パーマー3世（1997）。「リラクゼーションと動的プロセス」（PDF）。 2019年2月13日にオリジナル（PDF）からアーカイブされました。