有糸分裂からの脱出

有糸分裂からの離脱は、細胞にとって有糸分裂の終了と新しいG1 期の開始を示す重要な移行点であり、細胞は、有糸分裂から離脱したら、G1、S、G2 期を経て必要なチェックポイントをすべて通過するまで有糸分裂に戻らないように、特定の制御機構に頼る必要があります。サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)、ユビキチンリガーゼ、サイクリン依存性キナーゼの阻害剤、可逆的リン酸化など多くの因子が有糸分裂からの離脱を制御し、細胞周期イベントが正しい順序でエラーが最小限になるようにします。^{[ 1 ]}有糸分裂の終了は、紡錘体の崩壊、短縮した動原体微小管、および星状体 (非動原体) 微小管の顕著な伸長によって特徴付けられます。正常な真核細胞では、有糸分裂からの離脱は不可逆です。^{[ 2 ]}

真核生物モデル生物である出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいて、細胞が有糸分裂からの不可逆性を促進するために用いる制御機構に関して、多くの憶測がなされてきた。細胞周期調節因子のタンパク質分解と、それに伴うサイクリン依存性キナーゼのレベルへの影響が、真核細胞周期、特に中期から後期への移行を促進するメカニズムとして提案されている。この理論では、ユビキチンリガーゼの一種である後期促進複合体(APC) が、有糸分裂サイクリン (Clb2) および後期阻害因子 (PDS1、CUT2) の分解を促進して有糸分裂からの脱出を促進する。^{[ 3 ]} APC は、有糸分裂サイクリンのNH2 末端ドメインにある破壊ボックス (D ボックス) として知られる 9 アミノ酸モチーフをユビキチン化し、プロテアソームによる分解を促す。^{[ 3 ]} APCはCdc20と結合して（APC-Cdc20）、初期段階で有糸分裂サイクリン（Clb2）をユビキチン化して分解の標的とする。同時に、APC-Cdc20は、結合によって分離酵素を阻害するセキュリンの分解を、後期開始時に媒介する。放出されて活性化した分離酵素は、姉妹染色分体を一緒に保持していたコヒーシンを切断し、姉妹染色分体の分離を促進し、核小体からのCdc14の放出を促進することによって有糸分裂からの脱出を開始する。^{[ 4 ] [ 5 ]}後期段階では、Cdk1のダウンレギュレーションとCdh1活性化ホスファターゼであるCdc14の活性化により、Cdh1と結合したAPC（APC-Cdh1）の形成が促進され、Clb2が分解される。^{[ 2 ]} APCの活性化因子であるCdc20とCdh1は、セキュリンやB型サイクリン(Clb)などの基質をリクルートしてユビキチン化します。^{[ 6 ]} Cdk1-Clb2複合体がSli15、Ase1、 Ask1などの紡錘体ダイナミクスに関与するタンパク質をリン酸化しないと、紡錘体の伸長と染色体分離が促進され、有糸分裂からの脱出が促進されます。^{[ 2 ]} 真核細胞周期におけるタンパク質分解の重要性により、細胞分裂は単純なキナーゼカスケードから、リン酸化、ユビキチン化、タンパク質分解間の相互作用が必要なより複雑なプロセスへと見方が変わりました。^{[ 3 ]}しかし、INM-PP1（ATPアナログ）感受性Cdkアレルであるcdc28-as1を持つ出芽酵母細胞を用いた実験では、B型サイクリン（Clb）の破壊は不可逆的な有糸分裂からの脱出を誘発するために必要ではないことが証明された。^{[ 2 ]}Clb2の分解は、不可逆的な有糸分裂からの離脱を誘発するために必要なCdk1阻害期間を短縮した。これは、サイクリンのタンパク質分解が、その作用のタイムスケールが遅いため、真核細胞周期の動的な性質に寄与しているが、不可逆的な細胞周期遷移を誘発する主要な決定要因である可能性は低いことを示している。^{[ 2 ]}

真核細胞周期の調節において、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子のレベルが重要であることを示す発見がなされた。特に、出芽酵母のClb-CDK複合体の化学量論的阻害因子であるSic1のレベルは、 S期キナーゼを不可逆的に活性化することにより、不可逆的なG1-S期移行において特に重要であることが示された。 ^{[ 7 ]} Sic1レベルは、G1-S期移行だけでなく、不可逆的な有糸分裂終結（M-G1期移行）の引き金となる主要な役割を果たすことが示された。有糸分裂中、Cdk1レベルの低下は、Cdh1およびSic1タンパク質の転写活性化因子であるSwi5の活性化を介してCdk1に対抗するホスファターゼであるCdc14の活性化につながる。^{[ 8 ]} Sic1 がある一定の低レベルまで分解されると S 期の開始が引き起こされるが、不可逆的な有糸分裂からの脱出を誘発するには、Sic1 がある一定の高レベルまで蓄積する必要があった。^{[ 2 ]} Cdk1 阻害剤は、分解されない Clbs またはプロテアソーム阻害剤の発現によって B 型サイクリンの分解が阻害された場合でも、有糸分裂からの脱出を誘導することができた。しかし、姉妹染色分体は分離せず、阻害剤が洗い流されると細胞は有糸分裂に戻った。これは、サイクリンの分解とは無関係に、不可逆的な有糸分裂からの脱出を誘発するには、阻害剤の閾値レベルに達する必要があることを示している。^{[ 9 ]} G1-S 移行と比較して有糸分裂からの脱出を誘発するために必要な Sic1 レベルの閾値は異なるが、Sic1 レベルは CDK の活性を阻害することによって真核細胞周期の調節に重要な役割を果たすことが示された。

真核細胞の細胞周期にはさまざまなタンパク質と調節的相互作用が関わっているため、動的システムアプローチを採用することで、複雑な生物学的回路を一般的なフレームワークに単純化して、より優れた分析を行うことができます。^{[ 10 ] [ 11 ]}可能な 4 つの入出力関係のうち、Sic1 レベルと有糸分裂からの脱出の関係は、APC-Cdh1、Sic1、および Clb2-Cdk1 間のフィードバックによって駆動される不可逆的な双安定スイッチの特性を示しているようです。^{[ 2 ]}双安定性は、細胞周期制御や細胞分化などの生物学的機能を制御することが知られており、多くの細胞制御ネットワークで重要な役割を果たしています。^{[ 12 ]}双安定入出力関係は、2 つの分岐点を持つ 2 つの安定状態によって特徴付けられます。双安定領域では、1 つの特定の入力に対して複数の出力が可能であり、2 つの分岐点で示されます。さらに、双安定関係はヒステリシスを示します。システムが記憶を持っているため、最終的な状態/出力は入力の履歴と入力の現在の値に依存します。^{[ 10 ]}一方の分岐点には負の制御パラメータ値があり（分岐点は軸の反対側にある）、その結果、2 つの安定状態が切断され、一方の状態から他方の状態への遷移が不可逆になります。有糸分裂の終了に関して、2 つの安定状態は有糸分裂と G1 期によって定義されます。Sic1 レベル（入力）が閾値を超えて蓄積すると、有糸分裂（安定状態 I）から G1 期（安定状態 II）への不可逆的な遷移が発生します。不完全な環境では、そのまま残る唯一の分岐はサドルノード分岐です。サドルノード分岐は崩壊しません（サドルノードは期待される一般的な挙動です）が、不完全性の存在下では、臨界横断分岐とピッチフォーク分岐は崩壊します。^{[ 13 ]}したがって、不完全な生物学的世界で存在できる唯一の一次元分岐は、サドルノード分岐です。^{[ 10 ]} M-G1遷移とSic1レベルの間の双安定関係は、制御パラメータであるSic1の量のわずかな変化によってシステムの挙動が質的に変化する2つのサドルノード分岐の図として表すことができる。

細胞周期の挙動はM-G1移行状態におけるSic1の量に大きく依存するため、Sic1の量はシステムレベルのフィードバックによって厳密に制御されている。Cdk1-Clb2はSic1をリン酸化してユビキチン化による分解を可能にすることでSic1を阻害するため、APC-Cdh1依存的なCdk1-Clb2の分解は利用可能なCdk1-Clb2複合体のレベルを低下させるだけでなく、Sic1のレベルを上昇させ、それがさらにCdk1-Clb2の機能を阻害する。^{[ 8 ]}この二重負のフィードバックループの活性化は、APC-Cdc20依存的なCdk1-Clb2の分解と核小体タンパク質Net1/Cfi1からのCdc14の放出によって開始される。^{[ 14 ]} FEAR (Cdc14 早期後期放出) 経路は、Net1 の Clb2-Cdk1 依存性リン酸化を促進し、Net1 から Cdc14 を一時的に放出します。^{[ 15 ]}放出された Cdc14 と Clb2-Cdk1 複合体は紡錘体を形成し、有糸分裂出口ネットワーク (MEN) を活性化します。MEN は核小体からの Cdc14 の持続的な放出を可能にし、^{[ 15 ]} Cdc14 は Cdh1 を活性化し、Sic1 転写活性化因子 Swi5 の活性化を介して Sic1 を安定化させることにより、Clb2-Cdk1 の活性に対抗します。^{[ 16 ]} Sic1 は Cdk1-Clb2 を阻害して Swi5 の阻害を解除することで自身を正に制御し、Cdh1 もまた Clb2-Cdk1 を阻害して MEN の阻害を解除することで自身を正に制御し、MEN は Cdc14 を活性化し、続いて Cdh1 自身を活性化する。APC-Cdh1 と Sic1 によって形成される二重負のフィードバックループは、Clb2 が転写因子 Fkh2– Mcm1 Ndd1 複合体を活性化することで合成を自己活性化するため、Clb2-Cdk1 の活性を低く維持するために必要である。^{[ 8 ]}

真核細胞の細胞周期は、正確かつ正常な細胞分裂を保証するために、さまざまなチェックポイントとフィードバックループで構成されています。たとえば、有糸分裂中に、複製された染色体が有糸分裂紡錘体に不適切に付着すると、 Mad や Bub などの紡錘体アセンブリチェックポイント(SAC) タンパク質が APC-Cdc20 を阻害して、後期への移行と B 型サイクリンの分解を遅らせます。さらに、有糸分裂紡錘体がミスアライメントされると、Bub2 および Bfa1 依存的に MEN とそれに続く Cdc14 が阻害され、有糸分裂サイクリンの分解と後期への移行が防止されます。^{[ 16 ]} Sic1 は、システムレベルのフィードバックがどのように相互作用して環境条件を感知し、細胞周期の遷移を引き起こすかを示す良い例です。実際の M-G1 移行は多数のタンパク質と制御が関与する非常に複雑なものですが、動的システムアプローチにより、この複雑なシステムを、出力 (有糸分裂からの脱出) が Sic1 の臨界濃度に依存する 2 つのサドルノード分岐を持つ双安定入力/出力関係に単純化することができます。一次元解析を使用すると、システムレベルの制御とフィードバックによって制御される真核細胞周期の多くの不可逆的な移行点を説明できる可能性があります。不可逆的な移行点の他の例としては、スタート (新しい細胞分裂周期への不可逆的なコミットメント) があり、これは、制御パラメータが Cln2、Whi5、およびSBF を含むシステムフィードバックによって厳密に制御される不可逆的な双安定スイッチによって説明できます。^{[ 17 ]}

有糸分裂の進行と終結の制御は極めて重要であり、この過程のエラーは異数性や癌につながる可能性がある。最近の研究、特にCdk1阻害剤フラボピリドールを用いた研究は、有糸分裂終結の可逆性という興味深い側面を明らかにし、細胞周期遷移の一方向性に関する長年の見解に疑問を投げかけている。^{[ 18 ]}有糸分裂終結を理解する上で中心となるのは、有糸分裂の進行を統制するキナーゼであるCdk1である。サイクリン、特にサイクリンAとBに結合することで活性化されるCdk1の活性は、有糸分裂中にピークに達する。^{[ 18 ]}これらのサイクリン、特にサイクリンBの適切なタイミングでの分解は、有糸分裂終結にとって極めて重要である。この分解によりCdk1基質の脱リン酸化が保証され、中期から後期への重要な移行、そして最終的には有糸分裂からの終結のタイミング機構として機能する。このような綿密な制御は、正常条件下での細胞周期段階の不可逆性に対する細胞のコミットメントを強調している。強力な Cdk1 阻害剤であるフラボピリドールの導入は、有糸分裂制御の理解に革命をもたらした。有糸分裂中の脊椎動物細胞にフラボピリドールを適用すると、細胞質分裂を伴う有糸分裂からの早期脱出が誘導されたが、注目すべきことに、その前に染色分体の分離は起こらなかった。^{[ 18 ]}この現象は、染色体が脱凝縮して新たに形成された核膜に包まれているにもかかわらず、細胞の中間体内に閉じ込められたままになるという興味深い「切断」表現型につながった（図 4）。フラボピリドールの研究から得られた最も注目すべき発見は、有糸分裂からの脱出の可逆性である。サイクリン分解に関与するプロテアソーム活性が阻害されると、フラボピリドールの効果は可逆的になる。^{[ 18 ]}フラボピリドールを除去すると、以前に有糸分裂から早期に離脱するように誘導された細胞は中期状態に戻ることができた。この逆転には、有糸分裂紡錘体の再構築、細胞質分裂溝の収縮、新たに形成された核膜の溶解、および染色体の再凝縮が関与している。有糸分裂からの離脱の可逆性は、サイクリン B の安定性に大きく依存している。 ^{[ 18 ]} MG132 のようなプロテアソーム阻害剤の存在など、サイクリン B が分解から保護されている条件下では、フラボピリドールによって誘導された有糸分裂からの離脱は逆転することができる。^{[ 18 ]}この発見は、非分解性サイクリン B1 を使用してさらに裏付けられ、安定化したサイクリン B を持つ細胞はフラボピリドールを除去すると中期に戻ることができ、サイクリン B の安定性と有糸分裂からの離脱の可逆性の間に直接的な相関があることが示された。^{[ 18 ]}

がん研究は、治療戦略として細胞分裂の阻害に長年焦点を当ててきた。微小管ダイナミクスを標的とする抗有糸分裂薬は、このアプローチの要となっている。しかし、その成功は、神経毒性などの副作用や固形腫瘍に対する限定的な有効性によってしばしば妨げられている。^{[ 19 ]}微小管ダイナミクスを標的とするタキサン類やビンカアルカロイドの使用は、がん治療の標準となっている。しかし、その有効性は、ニューロンの微小管の撹乱による神経毒性などの重篤な副作用によってしばしば損なわれている。さらに、紡錘体特異的抗有糸分裂薬は、神経毒性は低いものの、固形腫瘍に対する成功は限定的であり、従来の薬剤と同等かそれ以下であることが多い。 ^{[ 19 ]}この状況は、より効果的で毒性の低い代替抗有糸分裂戦略の必要性を強調している。最近の研究は、有糸分裂からの離脱プロセス、特にこの段階を阻害することを新しい抗がん戦略として焦点を移している。この文脈における重要な役割を担うのは、アナフェーズ促進複合体/シクロソーム（APC/C）を活性化し、サイクリンB1の分解と有糸分裂からの離脱を引き起こす調節タンパク質であるCdc20です。RNAi技術を用いたCdc20のノックダウンは、有糸分裂の長期停止を誘導し、細胞死に至ります。^{[ 19 ]}このアプローチは、アポトーシスに抵抗性を持つ細胞や、スリップ（薬剤誘導性停止からの逃避）を起こしやすい細胞を含む癌細胞を殺す上で、紡錘体阻害薬よりも効果的であることが示されています。^{[ 19 ]} Cdc20のノックダウンは、サイクリンB1レベルを安定化させることで持続的な有糸分裂停止を引き起こし、それによってスリップを防ぎます。この長期停止により、アポトーシス機構が活性化して癌細胞を殺すための時間が長くなります。紡錘体阻害薬とは異なり、この戦略は紡錘体アセンブリチェックポイント（SAC）の活性化に依存しておらず、SAC欠損細胞でも効果的です。^{[ 19 ]}さらに、Cdc20 のノックダウンは、ミトコンドリア外膜透過性亢進 (MOMP) 依存性および非依存性の両方の経路を介して細胞死を誘導するため、より広範囲の癌細胞タイプに対して有効です (図 5)。^{[ 19 ]}有糸分裂終結の阻害は、従来の紡錘体標的薬に比べていくつかの利点がある。第一に、微小管の撹乱に伴う神経毒性を回避できる。第二に、その有効性はSAC活性や、スリップによる細胞死回避能力によって制限されない。最後に、細胞分裂の基本的かつ後期の段階を標的とするため、紡錘体形成などの初期段階を標的とする薬剤に比べて、耐性発達の可能性を低減できる可能性がある。がん治療として有望ではあるが、有糸分裂終結を標的とすることには課題がないわけではない。Cdc20や他の有糸分裂終結タンパク質の特異的で強力な阻害剤を開発することは大きな障害である。^{[ 19 ]}さらに、有糸分裂停止が長期化することで細胞死が誘導される正確なメカニズムを理解し、これらの経路内の潜在的な薬剤標的を特定することは、依然として重要な研究分野である。

出芽酵母では、有糸分裂からの脱出プロセスには、細胞極性と有糸分裂制御の概念が絡み合ったタンパク質のネットワークが関与しています。このネットワークの中心には、細胞周期ホスファターゼであるCdc14と様々な細胞極性タンパク質の役割があり、これらが集合的に細胞周期の有糸分裂からG1期への秩序だった移行を保証します。^{[ 20 ]} Cdc14は、Cdh1/Hct1やSic1などの主要な標的を脱リン酸化することで、有糸分裂からの脱出において極めて重要な役割を果たします。^{[ 20 ]}この作用により、有糸分裂サイクリン依存性キナーゼ（Cdk-Clb）活性が低下し、有糸分裂からの脱出の前提条件となります。Cdc14の制御は厳密に制御されており、間期と中期には核小体に隔離され、後期の開始時に放出されます。この放出は、Cdc14が有糸分裂からの脱出を誘発する機能を果たすために不可欠です。^{[ 20 ]}核小体からの Cdc14 の放出には、2 つの重要なステップが含まれます。最初の部分放出は、セパラーゼ (Esp1) とポロキナーゼ (Cdc5) によって促進され、その後、有糸分裂出口ネットワーク (MEN) によって制御される完全な放出が続きます。^{[ 20 ]} MEN は、有糸分裂出口に重要な GTPase 駆動シグナル伝達ネットワークであり、その適切な機能は細胞周期の忠実性に不可欠です。^{[ 20 ]} MEN の重要なプレーヤーは、小さな Ras 様 GTPase である Tem1 です。Tem1 の制御は複雑で、Bfa1-Bub2 GAP 複合体による不活性化と GEF Lte1 による活性化が関与しています。^{[ 20 ]}これらの相互作用の空間ダイナミクスが重要です。Tem1 は紡錘体極体 (SPB) と関連していますが、Lte1 は芽皮質と関連していますが、母細胞とは関連していません。この仕組みにより、MENの活性化、ひいては有糸分裂からの脱出は、核が芽の中で正しい位置にある場合にのみ起こることが保証されます。Cdc24、Cdc42、およびSte20タンパク質は、Lte1および他のMEN構成要素との相互作用を通じて、有糸分裂からの脱出が厳密に制御され、適切な条件下でのみ起こることを保証するために重要な役割を果たします（図6）。^{[ 20 ]}例えば、細胞極性タンパク質Cdc42はSte20の活性を調節し、これらの経路の相互接続性を強調しています。^{[ 20 ]}