マクサム・ギルバート配列決定

マクサム・ギルバート法は、1976年から1977年にかけてアラン・マクサムとウォルター・ギルバートによって開発されたDNA配列決定法である。この方法は、DNAの塩基特異的な部分的化学修飾と、修飾されたヌクレオチドに隣接する部位でのDNA骨格の切断に基づいている。^{[ 1 ]}

マクサム・ギルバート法は、DNA配列決定法として最初に広く採用された方法であり、サンガー・ジデオキシ法とともに、第一世代のDNA配列決定法を代表するものです。マクサム・ギルバート法は、次世代配列決定法に取って代わられ、現在では広く用いられていません。

マクサムとギルバートは、フレデリック・サンガーとアラン・コールソンがプラスマイナス配列決定法を発表してから2年後に化学配列決定法を発表しましたが、 ^{[ 2 ] [ 3 ]}精製したDNAを直接使用できるため、マクサム-ギルバート配列決定法は急速に普及しました。一方、初期のサンガー法では、各リードの開始点をクローニングして一本鎖DNAを生成する必要がありました。しかし、鎖終結法の改良（下記参照）により、マクサム-ギルバート配列決定法は、標準的な分子生物学キットでの使用を妨げる技術的な複雑さ、危険な化学物質の多用、スケールアップの困難さから、人気がなくなりました。^{[ 4 ]}

アラン・マクサムとウォルター・ギルバートの1977年の論文「DNA配列決定のための新しい方法」は、2017年にアメリカ化学会化学史部門から化学ブレークスルー賞を授与されました。この賞はハーバード大学分子細胞生物学部へ贈られました。^{[ 5 ]}

Maxam–Gilbert シーケンス法では、シーケンスする DNA 断片の5' 末端の1 つに放射性標識(通常はγ- ³² P ATPを使用したキナーゼ反応による) と DNA の精製が必要です。化学処理により、4 つの反応 (G、A+G、C、C+T) のそれぞれで、4 つのヌクレオチド塩基のうち 1 つまたは 2 つのごく一部に切断が生じます。たとえば、プリン( A+G) はギ酸を使用して脱プリン化され、グアニン(およびある程度アデニン) はジメチル硫酸でメチル化され、ピリミジン(C+T) はヒドラジンを使用して加水分解されます。ヒドラジン反応に塩 (塩化ナトリウム)を加えると、 C のみの反応におけるチミンの反応が阻害されます。修飾された DNA は、修飾された塩基の位置で熱ピペリジン(CH ₂ ) ₅ NHによって切断されます。修飾化学物質の濃度は、DNA分子1個あたり平均1つの修飾が導入されるように制御される。こうして、放射性標識された末端から各分子の最初の切断部位まで、一連の標識断片が生成される。

4つの反応で得られた断片は、サイズ分離のために変性アクリルアミドゲル中で並べて電気泳動される。断片を可視化するために、ゲルはオートラジオグラフィー用のX線フィルムに露光され、それぞれが同一の放射性標識DNA分子の位置を示す一連の暗いバンドが得られる。特定の断片の存在と非存在から配列を推測することができる。^{[ 1 ] [ 6 ]}

この方法により、 DNA結合タンパク質のDNA結合部位をマッピングするために使用されるメチル化干渉アッセイが開発されました。^{[ 7 ]}

自動化されたMaxam–Gilbertシーケンスプロトコルは1994年に開発された。^{[ 8 ]}

• サンガーシーケンス