格子光シート顕微鏡

格子光シート顕微鏡法は、光シート蛍光顕微鏡法の改良版であり 、画像取得速度を上げながら光毒性による細胞へのダメージを軽減します。これは、構造化された光シートを使用して標本の連続面で蛍光を励起し、動的な生物学的プロセスに関する情報を提供できる3D画像の時系列を生成することによって実現されます。^{[1] [2]}

これは2010年代初頭にエリック・ベッツィグ率いるチームによって開発されました。^[1]ワシントンポスト紙のインタビューによると、ベッツィグ氏はこの開発が「超解像蛍光顕微鏡の開発」で2014年のノーベル化学賞を受賞した研究よりも大きな影響を与えると考えています。^[3]

格子光シート顕微鏡は、光シート蛍光顕微鏡、ベッセルビーム顕微鏡、超解像顕微鏡（特に構造化照明顕微鏡、SIM ^[4]） の技術を組み合わせた新しい方法です。

格子光シート顕微鏡法では、光シート顕微鏡法と非常によく似て、サンプルの照明は画像検出に対して垂直に行われます。最初に、直線偏光した円形の入力ビームを一対の円筒レンズでx軸に沿って引き伸ばし、次に追加の一対のレンズでz軸に沿って圧縮することによって光シートが形成されます。^[5] この変更により薄い光のシートが作成され、バイナリ強誘電体空間光変調器(SLM) に投影されます。 SLM は、光線の波形を空間的に変化させるデバイスです。 SLM から反射された光は、不要な回折を除去するために使用されます。 回折は、透明な環状部を含む不透明なマスクで反射光からフラウンホーファー回折パターンを作成する変換レンズによって除去されます。^[5]光格子は2次元または3次元の干渉パターンであり、ここでは透明な環状リングによって生成されます。マスクは、xおよびzガルバノメータと共役です。顕微鏡のこの特性は、光シートを x 軸内で振動させる必要があるディザリング動作モードにとって重要です。

格子光シート顕微鏡には 2 つの動作モードがあります。ディザモードでは、光シートは x 軸に沿って高速にスキャンされ、通常の回折限界解像度で、Z 平面ごとに 1 つの画像のみが記録されます。^[1] 2 番目の動作モードは、構造化照明顕微鏡モード (SIM) です。SIM は、励起光のグリッド パターンをサンプルに重ね合わせ、各画像のキャプチャ間で段階的に回転させる手法です。^{[4] [6] [7]}これらの画像は、アルゴリズムによって処理され、光学機器に組み込まれている回折限界を超えた再構成画像が生成されます。

格子光シート顕微鏡は、軸方向分解能（Z方向分解能とも呼ばれる）の点でベッセルビーム光シート顕微鏡^{[8]の改良版とみなすことができます。ベッセルビーム光シート顕微鏡では、まず回折しない}ベッセルビームが生成され、次にX方向にディザリングされてシートが生成されます。しかし、ベッセル関数のローブは中心スポットと同じだけのエネルギーを運ぶため、観察対物レンズの被写界深度外に照明が当たることになります。

格子光シート顕微鏡法は、破壊的干渉によってベッセル関数の外側ローブの強度を低下させることを目的とします。そのためには、等間隔に配置されたベッセルビームの 2 次元格子を作成します。次に、ビーム間の間隔 (つまり、格子の周期) を慎重に調整することで、破壊的干渉をトリガーできます。

実際には、干渉するベッセルビームの格子は、空間光変調器(SLM)によって設計されます。空間光変調器は液晶デバイスであり、個々のピクセルをオン/オフにしてバイナリパターンを表示できます。SLM のマトリックス特性により、生成されたパターンには多くの不要な周波数が含まれます。したがって、これらは、対物レンズの背面焦点面と共役な平面(フーリエ領域) に配置された環状部によって除去されます。

最後に、格子ではなくサンプルで均一な強度を得るために、シートはx 方向に振動する ガルバノメータを使用してディザリングされます。

ラティス光シート顕微鏡法は、光退色によるサンプルの損傷を起こさずに、高解像度と鮮明さを高速画像取得で兼ね備えています。 [ ^1]光退色は蛍光顕微鏡法における重大かつ非常に一般的な問題であり、蛍光タグは繰り返し励起されると光子を放出する能力を失います。一般的な蛍光顕微鏡とは異なり、ラティス光シート顕微鏡法のサンプルは、従来の技術と比較して光退色が大幅に減少します（従来の技術では、これにより複数回の励起の過程で画像信号が弱くなります）。これにより、信号を失うことなくより長い露出が可能になり、結果としてより長い時間にわたってビデオをキャプチャできます。ラティス法は、1秒あたり200〜1000プレーンを分解する機能も備えており、これは連続的なビデオキャプチャを可能にする非常に高速な画像化速度です。このキャプチャ速度は、ベッセルビーム励起よりも1桁速く、スピニングディスク共焦点顕微鏡よりも2桁高速です。^[1]これら2つの利点を組み合わせることで、研究者は長期間にわたって非常に詳細な動画を撮影できるようになります。

格子光シート顕微鏡は、良好な画質を得るために透明で薄いサンプルに限られています。取得された画像の品質は、画像化の深さとともに低下します。この現象はサンプル誘起収差によって発生し、20～100μmを超えるサンプルの画像化には適応光学が必要になると提案されています。^[1]

• SIM: 150 nm x 230 nm x y 解像度、280 nm z 解像度
• ディザリング: 230 nm x 230 nm x y 解像度、約 370 nm z 解像度

• 励起バンドの幅は約 1.0 ミクロン、検出対物レンズの焦点深度は約 1.1 ミクロンの深さであるため、照射された分子の大部分は焦点面内にあります。

• 格子光シート技術と適応光学を組み合わせることで、20～100ミクロンを超える深さの画像化が可能になると考えられています。

格子光シート顕微鏡法は、生体内での細胞の位置特定や超解像に有用である。格子光シートの限定された励起帯域は、ほぼすべての照射細胞の焦点を保つ。大きな焦点外のスポットが減少することで、高密度の分子で個々の細胞を正確に追跡することができ、これは従来の顕微鏡法では達成できなかった能力である。^[1]その結果、格子光シートは多くの動的細胞相互作用に使用されている。光毒性の減少により、生きた組織を損傷することなく胚の細胞内プロセスを研究する機会が生まれた。研究では、有糸分裂中の微小管の非常に多様な成長パターンの範囲を調べ、定量化した。粘菌類ディクチオステリウム・ディスコイデウム（粘菌）細胞は、互いに向かう 急速な走化性運動と最初の接触中に画像化された。

T細胞と標的細胞の凝集と、それに続く免疫シナプスの形成が観察された。格子シート法の進歩により、これらの相互作用におけるアクチンの3次元運動パターンとラメリポディア突起が明らかになった。また、別の研究では、画像化速度の向上により、細胞外マトリックスを通過する高速で移動する好中球の観察も可能になった^[要出典]。

この技術は、化学および遺伝子操作技術とともに、ハーバード大学医学部が他の研究機関と協力して、初めて細胞のエンドソームに遺伝物質を注入することで、細胞に感染するウイルス（COVID-19タンパク質をスパイクするように設計されたウイルス）のライブ画像を撮影するために使用されました。^{[9] [10]}

この技術はハワード・ヒューズ医学研究所のジャネリア研究キャンパスで積極的に開発されている。^[11]エリック・ベツィグは顕微鏡研究と「生物系の内部を深く観察できる高速、高解像度、低衝撃のツール」の開発を目標としている。^{[3]格子光シート顕微鏡と}適応光学を組み合わせることで、20～100μmより深いところまで到達できる可能性がある。^[1]