試験管内毒性学

インビトロ 毒性試験は、培養された細菌または哺乳類細胞に対する化学物質の毒性効果を科学的に 分析するものです。 ^[1]インビトロ（文字通り「ガラスの中」）試験方法は、主に、治療薬、農薬、食品添加物などの潜在的に有用な新物質の開発の初期段階で、潜在的に危険な化学物質を特定したり、特定の毒性がないことを確認したりするために採用されています。

異物毒性のin vitro試験は、最近、人体へのリスクをより適切に評価するために、主要な政府機関（EPA、NIEHS/NTP、FDAなど）によって慎重に検討されています。毒性物質の作用のメカニズムの理解を深めるためにin vitroシステムを使用したり、ヒト特有の毒性効果を定義するためにヒト細胞や組織を使用したりするための活動が活発に行われています。^[2]

ほとんどの毒物学者は、in vitro毒性試験法は生きた動物での毒性学研究 ( in vivo法または「in life」法と呼ばれる)よりも有用で、時間と費用対効果が高いと考えています^[3]。しかし、in vitroからin vivoへの外挿には慎重な検討が必要であり、活発な研究分野となっています。

規制上の制約と倫理的配慮により、動物実験の代替手段の探求が新たな勢いを増しています。多くの場合、より安全な製品を開発するために使用できるため、in vitroテストは動物実験よりも優れています。^[4]

米国環境保護庁は、 ToxCast プログラム ( CompTox Chemicals Dashboardの一部)で、化学物質への曝露後の細胞代謝の変化に基づいて生体内発達毒性物質を予測するために、シリカモデリングとヒト多能性 幹細胞ベースのアッセイを使用して 1,065 種類の化学物質と薬物物質を調査しました。 2020年に公開されたこのToxCast_STMデータセットの分析から得られた主な知見は次のとおりです。(1) 1065種類の化学物質のうち19%で発達毒性の予測が得られました。(2) アッセイのパフォーマンスは、ヒトの出生前発達毒性のin vivo動物モデルと比較した場合、高い特異度(> 84%)と中程度の感度(< 67%)で79%～82%の精度に達しました。(3) 動物研究に厳格な証拠の重み付け要件が適用されたため、感度が向上しました。(4) ToxCastの特定の生化学的標的に対する最も強力な化学物質ヒットの統計的分析により、STM応答との正および負の関連性が明らかになり、標的エンドポイントとその生物学的ドメインのメカニズムの基礎に関する洞察が得られました。^[5]

細胞毒性やその他の細胞反応を調べるための試験物質の分析方法は数多く存在します。

溶血試験は、化学物質、薬物、医薬品、または血液に接触する医療機器や材料が赤血球を溶解する傾向を調べるものです。溶血はヘモグロビンの放出により簡単に検出されます。^[6]

MTT アッセイは、細胞生存率の判定によく使用され、国際機関によって使用が認められています。MTT アッセイには、アッセイを化学物質に導入し、その後可溶化するという 2 つのステップが含まれます。

比色MTS (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H テトラゾリウム) in vitro アッセイは、検証済みの MTT 法の最新版であり、MTS アッセイには可溶性であるという利点があります。したがって、可溶化ステップは必要ありません。

ATPアッセイの主な利点は、結果が早く（15分以内）得られ、サンプル細胞が少なくて済むことです。アッセイは細胞を溶解し、アッセイと細胞内のATP含有量の間の化学反応によって発光が発生します。発光量は光度計で測定され、生存細胞数に変換されます。

• ATPアッセイでは、生きている細胞の中にまだATPが含まれていると仮定し、
• 記録される発光レベルは、サンプル細胞内の ATP 含有量に比例します。

細胞生存率のもう 1 つのエンドポイントは、ニュートラル レッド(NR) の取り込みです。弱いカチオン性染料であるニュートラル レッドは、非拡散によって細胞膜を透過し、リソソーム内の細胞間に蓄積します。生存細胞​​は NR 染料を取り込み、損傷した細胞や死んだ細胞は取り込みません。

ELISAキットは、サイトカイン (IL-1、TNF アルファ、PGE2) などの炎症誘発性メディエーターのアップレギュレーションとダウンレギュレーションを調べるために使用できます。

これらのタイプの細胞反応の測定は、試験物質と試験モデル（単層細胞培養、3D 組織モデル、組織切片）と の相互作用を明らかにする窓口となります。

大まかに言えば、実験を実行するために開発されたシステムの種類に応じて、 in vitro研究には 2 つの異なるタイプがあります。一般的に使用される 2 種類のシステムは、a) 静的ウェル プレート システムと b) マルチコンパートメント灌流システムです。

静的ウェルプレートまたはレイヤーシステムは、in vitro 研究で広く使用されている最も伝統的でシンプルな形式のアッセイです。これらのアッセイは非常にシンプルで、培養培地や細胞内の化学物質をモニタリングするための非常にアクセスしやすいテスト環境を提供するため、非常に有益です。ただし、これらのシンプルな静的ウェルプレートアッセイを使用する欠点は、体内で発生する細胞相互作用や生理学的流体流動状態を表現できないことです。

細胞相互作用に関連する問題を解決するために、新しい試験プラットフォームが開発されています。これらの新しいプラットフォームは、マルチコンパートメント灌流システムに基づいており、はるかに複雑です。^[7] これらのシステムの主な目的は、in vivo の状況に近い細胞培養環境を提供することで、in vivo メカニズムをより確実に再現することです。システム内の各コンパートメントは、生体の特定の器官を表しているため、各コンパートメントには特定の特性と基準があります。これらのシステムの各コンパートメントは、流体が流れるチューブとポンプで接続されており、in vivo の状況での血流を模倣しています。これらの灌流システムを使用する欠点は、静的システムと比較して、悪影響 (システムの生物学的および非生物学的コンポーネントの両方が研究中の化学物質の運命に与える影響) が大きいことです。システムの非生物学的コンポーネントの影響を減らすために、すべてのコンパートメントはガラス製で、接続チューブはテフロン製です。これらの in vitro システムで発生するこれらの非特異的結合に対処するために、いくつかの運動モデルが提案されています。^[8]

異なる培養条件をin vitroで使用することで生じる生物学的困難を改善するには、フラスコやマイクロウェルプレートで使用される従来のモデルを改良する必要があります。マイクロテクノロジーと組織工学の並行した発展により、これらの問題は「マイクロ流体バイオチップ」と呼ばれる新しい適切なツールを使用することで解決されます。^[9]