力スペクトル顕微鏡

フォーススペクトル顕微鏡法（FSM）は、細胞質内の集合的なランダム力を測定するために開発されたアクティブマイクロレオロジーの応用です。^[1]大きな不活性流動トレーサーを生細胞に注入すると、細胞骨格メッシュ内に留まり、活性モータータンパク質からの反響によって振動します。これらのランダム力の大きさは、トレーサー粒子の振動周波数から推測できます。光学顕微鏡を使用してトレーサー粒子の変動を追跡すると、細胞内分子輸送に対するアクティブランダム力の寄与をブラウン運動の寄与から分離できます。

FSMは、モータータンパク質によって生成される確率的な細胞内力を調べるために、ミン・グオとデイビッド・A・ワイツによって開発された。 ^[1]細胞質は液体の空隙とはほど遠く、細胞に構造的支持を与えるアクチンとミオシンの複雑な網目構造を含み、また小胞やミトコンドリアなどの細胞小器官を収容している。^{[2]細胞質内の}高分子の密集に関する最近の研究では、巨大分子の拡散のような動きが誤ってブラウン運動によるものとされているのではないかという懸念が生じている。^[3]むしろ、巨大分子が埋め込まれたアクチンフィラメントをランダムに引っ張るミオシンモータータンパク質が、細胞内で分子の拡散のような動きを引き起こしているのではないかという疑いがある。^{[3] [4]}グオらは、細胞内の粒子の動きが熱拡散によるものか、または細胞骨格を揺さぶる非筋肉のミオシンIIなどの活性モータータンパク質の影響によるものかを見分けるためのアッセイを開発した。

FSM は、細胞骨格メッシュサイズ (>50 nm) よりも大きいポリエチレングリコール(PEG)でコーティングされたトレーサー粒子を注入し、 ^[5]アクチンフィラメントとミオシンモータータンパク質のネットワークの間に沈降します。ミオシンモータータンパク質がアクチンフィラメントを引っ張って細胞作業を行うと、これらのアクチンの変動は必然的に隣接する PEG 化粒子を振動させます。トレーサーの変動の大きさは、総アクティブモーター力の大きさに比例します。したがって、トレーサー振動の変位を記録することで、FSM はアクティブモータータンパク質によって発揮される力の大きさを測定し、導き出すことができます。^[1]

PEG化トレーサーの変動はミオシンモーターの集合体力と結びついてフックのバネに例えられる。

${\displaystyle F=kx}$

ここで、振動変位を生成するために適用される力は、細胞内環境の有効バネ定数に比例する。振動中の変位は時間の空間関数であり、光学顕微鏡を使用して直接測定することができる。 ^[1]次に、フーリエ変換により、時間領域の情報を周波数領域にマッピングして、周波数の関数として有用な次元を導き出す。 ${\displaystyle F}$${\displaystyle x}$${\displaystyle k}$

${\displaystyle \langle \left(F(v)\right)^{2}\rangle =\langle \left(K(v)\right)^{2}\rangle *\langle \left(x(v)\right)^{2}\rangle }$

ここで、、およびは、確率的な力を説明するために使用される平均力、弾性、および変位の2次形式です。 ^[1]時間平均二乗変位 は、周波数領域から時間領域に戻すフーリエ変換によって取得できます。振動周波数のコンテキストでは、力の周波数スペクトルが高いほど、細胞の代謝活動が大きくなります。^{[6]独立したマイクロメカニカル測定により、細胞質の弾性を計算できます。}光ピンセット を使用してトレーサー粒子に所定の力を適用することにより、FSMは結果として生じる変位を測定し、弾性バネ定数を推定できます。^{[7] [8]}${\displaystyle \langle \left(F(v)\right)^{2}\rangle }$${\displaystyle \langle \left(K(v)\right)^{2}\rangle }$${\displaystyle \langle \left(x(v)\right)^{2}\rangle }$${\displaystyle MSD=\langle \left(X(t)\right)^{2}\rangle }$

光ピンセットを使用したトレーサー粒子の指向性振動は、加えられた力とほぼ同期した変位をもたらし、細胞質が物質的に弾性固体に近いことを示唆している。^[1]これは、細胞質は大きな分子が自由に拡散できる粘弾性流体であるという以前の仮説とはまったく対照的である。^[9] ATPが枯渇した細胞 では、非筋肉ミオシンIIが不活性化されており、FSM実験により、トレーサー粒子は細胞質が固まったかのように振動を停止することが明らかになった。^[1]ミオシンIIは、ATP加水分解を介してアクチンフィラメントに結合して引っ張るモータータンパク質である。^{[10]これは、栄養飢餓状態の}細菌では細胞質がガラス状物質に変化するという発見をさらに裏付けている。^[11]このように、モータータンパク質によるATP加水分解は細胞質の流動性を維持するために重要であり、これは小胞輸送と細胞骨格における拡散運動に重要であると考えられる。^[1]

FSMは、細胞内の一般的な活動状態を測定することで、特徴的に弾性が高く^[12]、運動性が高い悪性癌細胞を識別するために適用できます。悪性MCF-7乳癌細胞と良性MCF-10A乳癌細胞に対するFSM測定では、力のスペクトルに統計的に有意な分離が見られ、FSMで転移癌を検査できるようになりました。^[1] 細胞外環境の次元は、癌細胞のFSM測定に大きく影響します。3Dマトリックスでは、転移性乳癌細胞MDA-MB-231は、2Dプレートで培養された細胞よりも比較的固体の細胞質が多くありました。^[13]