FLP-FRT組み換え

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構造	スイスモデル
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部位特異的リコンビナーゼFlp
部位特異的リコンビナーゼFlp
識別子
生物	サッカロミセス・セレビシエ
シンボル	FLP1
ユニプロット	P03870
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遺伝学において、Flp - FRT組換えは部位特異的組換え技術であり、生体内で制御された条件下で生物の DNA を操作するためにますます使用されています。これはCre- lox組換えに類似していますが、パン酵母Saccharomyces cerevisiaeの 2 μ プラスミドに由来する組換え酵素フリッパーゼ ( Flp )による短いフリッパーゼ認識標的 ( FRT ) サイト間の配列の組換えを伴います。

34bpの最小FRT部位配列は、

^5'GAAGTTCCTATTC tctagaaa GAATAGGAACTTC^3'

フリッパーゼ（Flp）は、8bpスペーサーの両側にある13bpの5'-GAAGTTCCTATTC-3'アーム、すなわち逆方向の部位特異的組換え（交差領域）の両方に結合する。FRT媒介切断は、非対称の8bpコア領域（^5'tctagaaa^3'）が上の鎖に、この配列の後ろが下の鎖である。^[1]いくつかの変異型FRT部位が存在するが、組み換えは通常、2つの同一の FRT間でのみ起こり、同一でない（「異種特異的」）FRT間では起こらないのが一般的である。^[2]^[3]

生物学的機能

酵母では、この酵素は、まれなミスセグメンテーションイベントによって引き起こされる2μプラスミドのコピー数の減少を修正します。これは、DNA複製中に2μプラスミド上の2つの逆位反復間の組換えを引き起こすことによって行われます。これにより、1つの複製フォークの方向が変わり、1回の開始で複数のコピーラウンドが発生します。^[4]

FRT部位配列の変異

Senecoffら(1987) は、FRT 内のヌクレオチド置換が FLP を介した組み換えの有効性にどのように影響するかを調査しました。著者らは、FRT サイトの 1 つまたは両方で塩基置換を誘発し、サイト特異的組み換えを観察するために必要な FLP の濃度をテストしました。すべての塩基置換は、FRT サイト内の 13 ヌクレオチドのそれぞれに対して実行されました (例: G から A、T、および C)。まず、著者らは、FRT 配列内のほとんどの変異は、2 つのサイトのうちの 1 つだけに存在する場合、最小限の影響しか引き起こさないことを示しました。両方のサイトで変異が発生すると、FLP の効率は大幅に低下します。次に、著者らは、FLP の結合とサイト特異的組み換えの有効性にとってどのヌクレオチドが最も重要であるかに関するデータを提供しました。両方の FRT サイトの最初のヌクレオチドがシトシンに置換される (G から C)、3 番目のヌクレオチドがチミンに置換される (A から T)、または 7 番目のヌクレオチドがアデノシンに置換される (G から A) と、FLP を介した部位特異的組み換えの有効性は 100 倍以上低下します。^[5]一方、FRT サイトの 1 つだけで前述のヌクレオチドのいずれかの塩基置換を行うと、有効性はそれぞれ 10 倍、10 倍、5 倍低下します。^[5]

大文字のヌクレオチドの塩基置換により、FLP を介した部位特異的組み換え (野生型 x 変異体および変異体 x 変異体) が最も減少しました。

^5'ガアタグガアクット^3'^[5]

利用可能なコンストラクトの多くは、追加のアーム配列（5'-GAAGTCCTATTCC ガアグットティーシーティーシー-3') 上流要素から 1 塩基対離れて同じ方向にある:

^5'GAAGTTCCTATTC c GAAGTTCCTATTC tctagaaa G t ATAGGAACTTC^3'

このセグメントは切除には不要であるが、リコンビナーゼを介したカセット交換を含む統合には必須である。^[6]

組み換え活性を特定の器官に標的としたり、低レベルの組み換え活性を使用して細胞のサブセットのみの DNA を一貫して変更したりできるため、Flp- FRT は多細胞生物の遺伝子モザイクの構築に使用できます。この技術を使用すると、実験動物が他の器官でこの遺伝子が失われた場合に生き残れない場合でも、特定の対象器官での遺伝子の損失または変更を研究できます (空間制御)。誘導性プロモーターを使用して発生後期に組み換え活性をトリガーすることにより (時間制御) 、遺伝子の変更の影響を経時的に研究することもできます。これにより、変更が防止されます。

Flpの生化学的構造と作用メカニズム

生化学的に関連する構造と活性部位

Flp タンパク質は、Cre と同様に、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼです。^[7]このリコンビナーゼファミリーは、IB 型トポイソメラーゼ機構を介して機能し、2 本の別々の DNA 鎖の組み換えを引き起こします。^[7]組み換えは、2 段階のプロセスを繰り返して実行されます。最初の段階では、ホリデイジャンクション中間体が生成されます。2 番目の段階では、結果として生じる 2 本の相補鎖の組み換えが促進されます。ファミリー名が示すように、高度に保存されたチロシン求核剤が DNA 鎖を切断します。^[7]チロシンの求核特性は、DNA 切断ポイントで 3'-リン酸を攻撃して結合します。^[7]切断された DNA の結果として生じる 5'-ヒドロキシル基は求核剤として機能し、相補的に切断された DNA 鎖の 3'-リン酸を攻撃し、組み換えが成功します。^[7]チロシン残基の外側には、保存された触媒ペンタドがあります。このペンタドは、リジン（Lysβ）、2つのアルギニン（Arg I と II）、ヒスチジン（His-II）、およびヒスチジン/トリプトファン（His/Trp-III）で構成されており、FlpとCre（およびその他のIBトピオソメラーゼ）の活性部位に必須かつ高度に保存された残基群を構成しています。^[7]これらの他の残基は、DNA鎖上でのFlpの結合と配置の正しい方向に重要です。

FLPを介した部位特異的組換えの応用

初期の問題

熱不安定性

FLP-FRT リコンビナーゼの最初の応用は哺乳類ではうまくいきませんでした。FLP タンパク質は熱不安定性(高温で変性する) であり、そのためこれらのモデルシステムの体温が上昇するため哺乳類モデルでは役に立ちませんでした。しかし、特許と Cre-Lox 組み換えの使用に関する制限のため、より熱安定性の高い FLP-FRT カセットを作成することに大きな関心が集まりました。最初の結果のいくつかは、Buchholz ら( 1997) がEscherichia coliでのサイクリング突然変異誘発を利用して生み出しました。この研究では、著者らはE. coli 細胞に 2 つのプラスミドを導入しました。1 つはアラビノースプロモーターの下流でランダムに突然変異した FLP タンパク質をコードし、もう 1 つは FRT カセット内に lacZ 遺伝子プロモーターを含んでいます。大腸菌はアラビノースプレート上で37℃と40℃で培養され、組み換えが起こるとlacZ発現が弱まり、コロニーは白く見える。各世代から白いコロニーを選択し、新しいアラビノースプレート上で同じ温度で8世代にわたって培養した。^[8]ウェスタンブロッティングで組み換えを確認し、変異したFLP遺伝子を配列決定した後、この第8世代FLPタンパク質（FLPe）を哺乳類細胞培養に導入し、哺乳類細胞での組み換えを確認した。^[8]このFLP変異体には、P2S、L33S、Y108N、およびS294Pの4つのアミノ酸置換のみがある。

遺伝子モザイクの生成

遺伝子モザイクは、特定の遺伝子座における異なる遺伝子型のために、類似した細胞型が異なる表現型を発現する場合に、生物内で発生します。簡単に言えば、これは 1 つの生物が異なる遺伝子型を含む場合に発生しますが、これは通常、自然界ではまれです。ただし、これは FLP-FRT 組み換えを使用して簡単に (そして問題を抱えながら) 生成できます。細胞内に 2 つの異なる FRT サイトが存在し、FLP が適切な濃度で存在する場合、FRT カセットは引き続き切り出され、2 つの FRT サイトの間に挿入されます。このプロセスは、FLP タンパク質が必要な濃度を下回るまで続き、生物内の細胞が異なる遺伝子型を持つようになります。^[9]これはショウジョウバエからマウスまで見られ、特定の染色体 (体細胞および性別) または細胞型 (体細胞および生殖細胞) を区別しません。^[9]^[10]

細胞系統の決定

Dymecki et al . (1998)の発表以前には、Cre リコンビナーゼは、 En2プロモーターを用いたマウスの神経前駆細胞の細胞運命マッピングに使用されていました。^{[11]そのため、Dymecki}et al . (1998)の著者らは、マウスにおいて FLP リコンビナーゼが Cre リコンビナーゼと同様の方法で同様の効果で使用できると理論づけました。著者らは、2 つのトランスジェニックマウスラインを作成しました。1 つは神経 Wnt1::Flp 融合ライン、もう 1 つはtm1Cwrの 18 番目のエクソンに隣接する FRT カセットを持つラインです。^[9]著者らは、このエクソンを切除対象に選択しました。切除するとヌル表現型になるためです。著者らは 2 つのラインを交配し、子孫が成体になるまで待ってから犠牲にしました。神経、筋肉、腸、および尾の組織で RNA 抽出を行いました。逆転写PCRとノーザンブロッティングにより、tm1Cwrの18番目のエクソンの切除が脳組織で豊富に、筋肉組織で中程度に（筋肉内のScwhann細胞による）確認されました。予想通り、切除は他の組織では見られませんでした。著者らは、細胞運命決定におけるFLPリコンビナーゼの効率がCreリコンビナーゼと同等かそれ以上であることを確認しました。

でキイロショウジョウバエ（ミバエ）

現在までに、FlpリコンビナーゼはD. melanogasterで何度も利用されてきました。D . melanogasterにおけるFlpリコンビナーゼとCreリコンビナーゼの比較は、 Frickenhausら（ 2015 ）によって発表されました^[12]。Frickenhausら（2015）の著者らは、Flpリコンビナーゼ「ノックアウト」の有効性をCreリコンビナーゼ「ノックアウト」およびRNAiノックダウンと比較・特徴づけること、そしてD. melanogasterのニューロンおよび筋組織におけるFUSのハエ相同遺伝子であるcabeza（caz）の機能を明らかにするという2つの目的を持っていました。FUSは、ヒトの筋萎縮性側索硬化症（ALS）および前頭側頭型認知症に深く関与していることが示されています^[12]。著者らは、ニューロンで特異的にリコンビナーゼを発現させるためにelav - Gal4/UAS -Flp または Cre システムを使用し、筋肉で特異的に発現させるためにMef2 - Gal4/UAS-Flp または Cre システムを使用した。^[12]著者らは、Cre タンパク質と RNAi 転写の両方に見られる漏出発現がないため、特定の組織または細胞株で特定の遺伝子をノックアウトする目的では、Flp リコンビナーゼ「ノックアウト」ツールが RNAi および Cre リコンビナーゼの両方よりも効果的であると結論付けている。また、著者らは、Flp タンパク質では見られない Cre タンパク質の毒性を目撃した。^[12]

でダニオ・レリオ（ゼブラフィッシュ）

FLPeリコンビナーゼシステムの有効性は、Wongら（2009）によってゼブラフィッシュで評価されました。^[13]筋肉特異的プロモーターの下流にあるFRTに挟まれた増強緑色蛍光タンパク質（EGFP）のヘミ接合体である胚に、FLPeタンパク質を注入しました。FLPeがない場合、これらの胚はすべての筋肉組織でEGFPを発現するはずであり、野生型の鎖と交配した場合、結果として生じる子孫の50％も筋肉組織でEGFPを発現するはずです。FLPeを注入された胚は、筋肉組織でのEGFPの発現が著しく減少し、モザイク現象も見られました。^[13]これらの胚が成体に達すると、野生型の系統と交配され、その結果生じたクラッチでは、筋肉組織でEGFPを発現する子孫が著しく減少しました（0〜4％）。^[13]これらの結果は、FLPeが体細胞に非常に効果的であるだけでなく、ゼブラフィッシュの生殖細胞にも非常に効果的であることを示しています。

植物では

「植物センサー」または「センチネル」の作成シロイヌナズナタバコ

植物センサーは、生物的または非生物的汚染物質の存在を報告できる遺伝子組み換え植物です。^[14]これらの遺伝子組み換え植物の生産は、農業および実験室で大きな期待が寄せられています。しかし、適切なレポーターベクターの作成には問題があることがわかっています。シス調節要素は植物の遺伝子の転写活性化において重要な役割を果たしますが、その多くは十分に理解されていません。多くの植物センサーは、レポーター遺伝子を過小発現するか、合成プロモーターが原因で偽陽性を報告します。^[14] Rao et al. (2010) の著者らは、FLPリコンビナーゼツールを利用して、非常に効率的な植物センサーを製造しました。著者らは、熱ショックプロモーターを使用してFLPの生成を誘導し、FRTで挟まれたベクターを使用してCaMV 35Sプロモーターをβ-グルクロニダーゼ遺伝子 (GUS) から分離しました。植物が熱ショックにさらされると、FLP誘導によってFRTに挟まれたベクターが切除され、GUS遺伝子がCaMV 35Sプロモーターの下流に直接移動しました。GUSの活性化により、植物の葉は緑から青に変わりました。このように、植物センサーはモデルシステムにストレスを効果的に報告しました！^[14]

Creリコンビナーゼ

ゲートウェイ対応誘導性 MiRNA (GRIM) 発現システムの開発

RNA干渉（RNAi）は、真核生物における遺伝子発現および潜在的な遺伝子ノックアウトにパラダイムシフトをもたらしました。GRIM発現システムが開発される前は、RNAiベクターの作成は高価で時間のかかる作業でした。ベクターは、従来のコピーアンドペースト分子クローニング法によって作成されていました。^[15] Garwick-Coppensら（2011）は、RNAiの発現をCreリコンビナーゼを使用してノックインし、Flpリコンビナーゼを使用してノックアウトできる、はるかに効率的なRNAiベクター生成方法を開発しました。この新しいGRIM発現システムにより、人工RNAiコンストラクトを含む発現ベクターをはるかに迅速に生成できます。^[15]著者らはさらに、分子研究で一般的なヒト不死化細胞株であるヒト胎児腎臓（HEK）細胞で、この発現システムが非常に効果的に機能することを示しました。

参照

参考文献

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外部リンク

Flp-FRT リコンビナーゼ: 作用機序
D. melanoster 光受容体における Flp-FRT リコンビナーゼの利用に関するビデオ
コレラ菌の突然変異誘発におけるFLPの応用

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