コメットアッセイ

単一細胞ゲル電気泳動アッセイ（SCGE 、コメットアッセイとも呼ばれる）は、個々の真核細胞レベルでDNA 損傷を検出するための、複雑でない感度の高い技術です。1984 年に Östling と Johansson によって最初に開発され、その後1988 年にSinghらによって改良されました。^[1]それ以来、DNA 損傷/修復の評価、バイオモニタリング、遺伝毒性試験の標準技術として人気が高まっています。このアッセイでは、低融点アガロース懸濁液に細胞を封入し、中性またはアルカリ性（pH>13）の条件で細胞を溶解し、懸濁した溶解細胞を電気泳動します。「コメット」という用語は、電気泳動ゲルを通る DNA の移動パターンを指し、彗星に似ていることがよくあります。^{[2] [3]}

コメットアッセイ（単一細胞ゲル電気泳動）は、真核細胞におけるデオキシリボ核酸（DNA）鎖切断を測定するための簡単な方法です。顕微鏡スライド上のアガロースに埋め込まれた細胞は、洗剤と高塩分で溶解され、核マトリックスにリンクされたDNAの超らせんループを含む核様体を形成します。高pHでの電気泳動により、蛍光顕微鏡で観察すると彗星に似た構造が形成されます。彗星の頭部に対する尾部の強度は、DNA切断の数を反映しています。この根拠として考えられるのは、切断を含むループが超らせん構造を失い、陽極に向かって自由に伸びるようになることです。その後、DNAを染色して蛍光を計算し、DNA損傷の程度を判定する視覚分析が行われます。これは、手動でスコアリングするか、画像ソフトウェアによって自動的に実行できます。^{[4] [5]}

試験管内細胞培養または生体内試験 対象から採取した細胞サンプルを個々の細胞に分散させ、 37 °C で融解した低融点アガロースに懸濁します。この単一懸濁液を顕微鏡スライド上に流し込みます。ガラスカバースリップを斜めに保持し、単一懸濁液をカバースリップとスライドの接触点に塗布します。カバースリップをスライド上に降ろすと、融解したアガロースが広がって薄い層を形成します。アガロースは 4 °C でゲル化し、カバースリップを取り除きます。

アガロースは、細胞を包み込み、所定の位置に固定する炭水化物繊維のマトリックスを形成します。アガロースは浸透圧中性であると考えられているため、溶液はゲルに浸透し、細胞の位置を変えることなく細胞に影響を与えることができます。

試験管内研究では、細胞を試験物質（通常は紫外線、電離放射線、遺伝毒性化学物質）にさらして、カプセル化された細胞に DNA 損傷を誘発します。較正では、通常、過酸化水素を使用して DNA 損傷の標準レベルを提供します。

次に、スライドを細胞を溶解させる溶液に浸します。コメットアッセイでよく使用される溶解溶液は、高濃度水性塩（多くの場合、一般的な食卓塩を使用できます）と洗剤（ Triton X-100またはサルコシン酸など）で構成されています。研究者が調査している損傷の種類に応じて、 溶解溶液のpHを調整できます（通常は中性からアルカリ性pH の間）。

水性塩は細胞内のタンパク質とその結合パターンを破壊し、細胞のRNA含有量を破壊します。洗剤は細胞膜を溶解します。溶解液の作用により、細胞は破壊されます。すべてのタンパク質、RNA、膜、細胞質および核質の成分が破壊され、アガロースマトリックスに拡散します。細胞のDNAのみが残り、解けて、以前は細胞全体が満ちていたアガロースの空洞を埋めます。この構造は核様体（DNAが集中している構造の一般的な用語）と呼ばれます。

細胞を溶解した後 (通常 4 °C で 1 ～ 2 時間)、スライドを蒸留水で洗浄してすべての塩分を除去し、2 番目の溶液 (電気泳動溶液) に浸します。この溶液も、調査対象の損傷の種類に応じて pH を調整できます。

スライドは、電界を印加する前に、電気泳動溶液に約 20 分間放置されます。アルカリ性条件では、DNA の二重らせんが変性し、核様体が一本鎖になります。

電界（通常 1 V / cm）を約 20 分間適用します。次に、スライドを pH 7 に中和し、DNA 固有の蛍光染料で染色し、画像分析ソフトウェアを搭載したコンピューターに接続された CCD（電荷結合素子、基本的にはデジタル カメラ）を備えた顕微鏡を使用して分析します。

SCGE アッセイの根底にある概念は、損傷を受けていない DNA は核内のマトリックス タンパク質と高度に組織化された関係を維持するというものです。損傷を受けると、この組織化は乱れます。個々の DNA 鎖はコンパクトな構造を失い、緩んで、空洞からアガロース内に広がります。電場が適用される場合、全体的に負に帯電している DNA は、正に帯電した陽極に向かって引き寄せられます。損傷を受けていない DNA 鎖は大きすぎて空洞から出ませんが、断片が小さいほど、一定時間内に自由に移動できる距離が長くなります。したがって、空洞から出る DNA の量は、細胞内の DNA 損傷の量の尺度となります。

画像分析では、核様体全体の蛍光の全体的な強度と移動した DNA の蛍光を測定し、2 つの信号を比較します。移動した DNA からの信号が強いほど、損傷が大きいことを意味します。全体的な構造は彗星に似ており(そのため「彗星アッセイ」と呼ばれます)、円形の頭部は空洞内に残っている損傷していない DNA に対応し、尾は損傷した DNA です。尾が明るく長いほど、損傷のレベルが高くなります。

コメットアッセイは、損傷を検出するための多目的な技術であり、プロトコルを調整することで、さまざまな DNA 改変病変 (損傷) の存在を定量化するために使用できます。通常検出される損傷は、一本鎖切断と二本鎖切断です。一本鎖切断を検出するには、アルカリ性条件と DNA の完全な変性が必要であると時々言われます^{[6] [7] 。しかし、これは真実ではなく、一本鎖切断と二本鎖切断の両方が中性条件でも検出されます。 [8] [9] [10] [11]ただし、アルカリ性条件では、} AP サイト(ピリミジンまたはプリンヌクレオチドのいずれかが欠落している脱塩基サイト) と除去修復が行われているサイトなど、追加のDNA 構造が DNA 損傷として検出されます。^{[12] [13]}

コメットアッセイは、非常に感度の高いDNA損傷アッセイです。この感度は、結果の再現性に影響を与える可能性のある物理的変化にも脆弱であるため、慎重に扱う必要があります。基本的に、研究対象の因子以外でDNA損傷や変性を引き起こす可能性のあるものはすべて避ける必要があります。^[14]最も一般的なアッセイ形式はアルカリバージョンですが、決定的なアルカリアッセイプロトコルはまだありません。セットアップが簡単で安価なため、より複雑なアッセイが利用できない状況でも使用できます。

これらには、遺伝毒性試験、ヒトのバイオモニタリングと分子疫学、生態遺伝毒性学、およびDNA損傷と修復に関する基礎研究が含まれます。^[15] たとえば、スウェインとラオは、コメットアッセイ^{[16]を使用して、}加齢に伴うラットの脳ニューロンとアストロサイトで、一本鎖切断、二本鎖切断、および修飾塩基（8-OHdGとウラシル）を含むいくつかの種類のDNA損傷が著しく増加したと報告しました。

コメットアッセイは精子細胞におけるDNA断片化の程度を判定することができる。DNA断片化の程度は体外受精の結果と関連している。^{[17] [18]}

この彗星は男性不妊症の診断ツールとして精子細胞に使用するために改良されている^{[19] [20] [21]}

彗星を精子として利用するために、これらの強固に結合したプロタミンタンパク質を分解するには、脱凝縮プロトコルの追加ステップが必要である。^[20]

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