エイムズ試験

エイムズ試験は、細菌を用いて特定の化学物質が試験生物のDNAに突然変異を引き起こすかどうかを検査する、広く用いられている方法です。より正式には、化学物質の変異原性の可能性を評価するための生物学的アッセイです。^{[ 1 ]}陽性反応は、その化学物質が変異原性であり、したがって発がん物質として作用する可能性があることを示唆します。なぜなら、がんはしばしば突然変異と関連しているからです。マウスやラットを用いた標準的な発がん性試験は時間がかかり（完了までに2～3年かかる）、費用も高額であるため、この試験は化合物の発がん性の可能性を推定するための迅速かつ簡便なアッセイとして役立ちます。ただし、偽陽性や偽陰性が発生することが知られています。^{[ 2 ]}

この手順は、1970年代初頭にカリフォルニア大学バークレー校のブルース・エイムズとそのグループによって一連の論文で説明されました。^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}

エイムズ試験では、ヒスチジン生合成に関わる遺伝子に変異を持つサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）の複数の株が用いられます。これらの株は栄養要求性変異株、すなわち増殖にヒスチジンを必要とするものの、ヒスチジンを産生できない株です。この試験法では、試験物質が変異を引き起こして「栄養要求性」の状態に戻る能力、つまり細胞がヒスチジンを含まない培地で増殖できる状態に戻る能力を検証します。

試験菌株は、ヒスチジン合成に必要な遺伝子のフレームシフト変異（例：TA-1537株およびTA-1538株）または点変異（例：TA-1531株）を検出するように特別に構築されており、異なるメカニズムを介して作用する変異原を特定することができます。一部の化合物は非常に特異的で、1つまたは2つの菌株のみで復帰変異を引き起こします。 ^{[ 4 ]}試験菌株には、リポ多糖合成に関与する遺伝子の変異もあり、細菌の細胞壁の透過性を高めています。 ^{[ 5 ]}また、切除修復システムの変異もあり、試験の感度を高めています。^{[ 6 ]}

哺乳類のような大型生物は、変異原性がないと考えられる化学物質を変異原性を持つ化学物質に変えたり、変異原性があると考えられる化学物質を変異原性を持たない化学物質に変えたりする可能性のある代謝プロセスを持っています。^{[ 7 ]}したがって、大型生物との関連で化学物質の変異原性をより効果的にテストするために、エイムズ試験でテストされる化合物に対する代謝プロセスの影響を再現するために、ラット肝臓酵素を添加することができます。一部の化合物、例えばベンゾ[ a ]ピレンなどはそれ自体は変異原性を持たないが、その代謝産物は変異原性を持つため、代謝の影響をシミュレートするためにラット肝臓抽出物を任意で添加します。^{[ 3 ]}

細菌は、少量のヒスチジンを含む寒天培地に塗布される。培地中の少量のヒスチジンによって、細菌は初期段階で増殖し、変異する機会を得る。ヒスチジンが枯渇すると、ヒスチジンを自ら生成する能力を獲得するように変異した細菌のみが生き残る。培地は48時間培養される。物質の変異原性は、観察されるコロニーの数に比例する。

エイムズ試験で特定された変異原物質は発がん性物質である可能性もあり、エイムズによる初期の研究では、既知の発がん性物質の90%がこの試験で特定できることが示されました。^{[ 8 ]} しかし、その後の研究では、既知の発がん性物質の50～70%が特定されることが示されました。 この試験は、以前は市販製品に使用されていた多くの化合物を潜在的な発がん性物質として特定するために使用されました。^{[ 9 ]} 例としては、子供用寝間着などのプラスチックや繊維の難燃剤として使用されていたトリス(2,3-ジブロモプロピル)リン酸^{[ 10 ]}や、 1960年代から1970年代にかけて日本で食品の抗菌添加物として使用されていたフリルフラミドなどがあります。フリルフラミドは実際には以前に動物実験に合格していましたが、エイムズ試験で特定された後のより厳しい試験で発がん性があることが示されました。^{[ 11 ]} これらの陽性試験の結果、これらの化学物質は消費者製品での使用から撤回されました。

エイムズ試験の興味深い結果の 1 つは、化学物質の濃度を変化させた場合の用量反応曲線がほぼ常に直線的であることであり、^{[ 8 ]}突然変異誘発の閾値濃度が存在しないことを示しています。したがって、放射線と同様に、化学的突然変異原や発がん物質にも安全な閾値が存在しない可能性があることを示唆しています。 ^{[ 12 ] [ 13 ]}しかし、生物はDNA 修復 などの保護機構により低レベルの突然変異原に耐えることができ、したがって特定の化学的突然変異原には閾値が存在する可能性があると提案する人もいます。^{[ 14 ]}ブルース・エイムズ自身は、動物系での発がん性試験で使用される高用量から、ヒトの曝露で通常遭遇する低用量の化学物質への線形用量反応の外挿に反対しました。なぜなら、そのような試験で使用される人工的に高用量の化学物質によって引き起こされる有糸分裂促進反応 により、結果が偽陽性になる可能性があるからです。^{[ 15 ] [ 16 ]} 彼はまた、「癌を引き起こすかもしれないし、引き起こさないかもしれない微量の化学物質に対するヒステリー」は「注意すべき主要なリスクを完全に無視してしまう」と警告した。^{[ 17 ]}

エイムズ試験は、潜在的な発がん物質を排除するための初期スクリーニングの1つとしてよく使用され、米国農薬法で義務付けられている8つの試験の1つであり、米国有害物質規制法で義務付けられている6つの試験の1つでもあります。^{[ 18 ]}

サルモネラ菌は原核生物であるため、ヒトの完全なモデルではありません。ラット肝臓S9分画は、哺乳類の代謝条件を模倣するために使用され、肝臓系で親分子から生成された代謝物の変異原性ポテンシャルを評価できます。しかし、ヒトとラットの代謝には違いがあり、試験対象の化学物質の変異原性に影響を与える可能性があります。^{[ 19 ]} したがって、ヒト肝臓S9分画を使用することで試験を改善できる可能性があります。以前は入手可能性によって使用が制限されていましたが、現在は市販されているため、より実現可能になる可能性があります。^{[ 20 ]}酵母などの真核細胞用に 改良されたin vitroモデルが作成されています。

エイムズ試験で特定された変異原物質は必ずしも発がん性物質であるとは限らず、試験で特定された発がん性物質の可能性のあるものについては、さらなる試験が必要です。硝酸塩を含む薬剤は、実際には安全であるにもかかわらず、エイムズ試験で陽性反応を示すことがあります。硝酸塩化合物は、偽陽性反応を引き起こす可能性のある重要なシグナル分子で ある一酸化窒素を生成することがあります。ニトログリセリンは、エイムズ試験で陽性反応を示すにもかかわらず、現在でも治療に使用されている例です。しかし、食品中の硝酸塩は、細菌の作用によって亜硝酸塩に還元されることがあり、亜硝酸塩はアミンやアミドと反応して発がん性物質を生成することが知られています。このような化合物については、エイムズ試験の陽性反応を否定するために、長期にわたる毒性試験とアウトカム研究が必要です。

エイムズ試験は、前述のように、当初は寒天培地（プレート混入法）を用いて開発されました。その後、エイムズ試験の代替法として「変動法」が開発されました。この方法は、寒天培地を用いた方法と概念は同じで、少量のヒスチジンを含む反応混合物に細菌を添加し、細菌が増殖・変異してヒスチジンを合成するというものです。pH指示薬を加えることで、マイクロプレート上で、細菌の代謝過程によるpH低下によって色が変化したウェルの数を数え、変異の頻度を測定します。従来のエイムズ試験と同様に、試料を自然な逆突然変異率と比較することで、物質の遺伝毒性を評価します。変動法は液体培養で実施され、96ウェルまたは384ウェルのマイクロプレートで、紫色から黄色に変化したウェルの数を数えることで評価します。

96ウェルプレート法では、突然変異の頻度は、96個のウェルのうち色が変化したウェルの数としてカウントされます。プレートは最長5日間培養され、毎日、突然変異した（黄色の）コロニーがカウントされ、確立された有意性表を使用して、背景の逆突然変異率と比較され、背景の突然変異率と試験サンプルの突然変異率との間の有意差が判定されます。

より簡略化された384ウェルプレートを用いた微量変動法では、変異頻度は、2日間の培養後に色が変化した48ウェル中数としてカウントされます。試験サンプルは、6つの用量レベルで、同時にゼロ用量（バックグラウンド）および陽性対照とともにアッセイされ、これらはすべて1枚の384ウェルプレートに収まります。統計的信頼性を確保するため、アッセイは3回繰り返して実施されます。このアッセイでは、OECDガイドライン471で推奨されている試験株（ヒスチジン要求性株およびトリプトファン要求性株）を使用します。

変動法は感度と精度において従来の平板培養法に匹敵するが、いくつかの利点がある。必要な試験サンプルが少なく、単純な比色終点があり、96 または 48 ウェルのうち陽性ウェルの数を数えるのは、寒天プレート上の個々のコロニーを数えるよりもはるかに時間がかからない。市販のキットがいくつか入手可能である。ほとんどのキットには、凍結乾燥細菌を含むすぐに使用できる消耗品コンポーネントが含まれており、マルチチャンネルピペットを使用してテストを実行できる。変動法では、より多くの量の水性サンプル (最大 75% v/v) をテストすることもでき、感度を高め、低レベルの環境変異原への適用範囲を広げることができる。^{[ 21 ]}