アフィニティークロマトグラフィー

さまざまな用途に対応する多くの異なる親和性媒体が存在する。^{[ 12 ] [ 9 ] [ 13 ]} 簡単に言うと、それらは（一般的に）活性化/機能化されており、機能的なスペーサー、サポートマトリックスとして機能し、毒性試薬の取り扱いを排除する。

アミノ酸培地は、様々な血清タンパク質、タンパク質、ペプチド、酵素、ならびにrRNAおよびdsDNAに使用されます。アビジンビオチン培地は、ビオチン／アビジンおよびその誘導体の精製プロセスに使用されます。

糖鎖結合は、糖タンパク質やその他の糖鎖含有物質に最もよく用いられます。糖鎖は、レクチン、糖タンパク質、またはその他の糖鎖代謝産物タンパク質に用いられます。色素リガンド媒体は非特異的ですが、生物学的基質やタンパク質を模倣します。グルタチオンは、GSTタグ付き組換えタンパク質の分離に有用です。ヘパリンは汎用的な親和性リガンドであり、血漿凝固タンパク質、核酸酵素、リパーゼの分離に最も有用です。

疎水性相互作用媒体は、遊離カルボキシル基やタンパク質を標的とするために最も一般的に使用される。

免疫親和性媒体（詳細は後述）は、抗原と抗体の高い特異性を利用して分離します。固定化金属親和性クロマトグラフィーは、さらに後述で詳しく説明しますが、金属イオンとタンパク質（通常は特殊なタグが付けられている）との相互作用を利用して分離します。ヌクレオチド/補酵素は、脱水素酵素、キナーゼ、トランスアミナーゼの分離に用いられます。

核酸は、mRNA、DNA、rRNA、およびその他の核酸／オリゴヌクレオチドを捕捉する働きをする。プロテインA/G法は、免疫グロブリンの精製に用いられる。

特殊培地は、特定のクラスまたはタイプのタンパク質／補酵素向けに設計されています。このタイプの培地は、特定のタンパク質または補酵素を分離するためにのみ機能します。

この手法のもう一つの用途は、血清からの抗体の親和性精製です。血清に特定の抗原に対する抗体が含まれていることが分かっている場合（例えば、血清が当該抗原に対して免疫された生物由来の場合）、その血清を用いて抗原の親和性精製を行うことができます。これは免疫親和性クロマトグラフィーとも呼ばれます。例えば、生物がGST融合タンパク質に対して免疫された場合、融合タンパク質に対する抗体、そして場合によってはGSTタグに対する抗体も産生されます。その後、このタンパク質をアガロースなどの固体支持体に共有結合させ、免疫血清からの抗体精製における親和性リガンドとして使用することができます。

徹底的な精製のため、GSTタンパク質とGST融合タンパク質はそれぞれ別々に結合させることができます。まず、血清をGSTアフィニティーマトリックスに結合させます。これにより、融合タンパク質のGST部分に対する抗体が除去されます。次に、血清を固相担体から分離し、GST融合タンパク質マトリックスに結合させます。これにより、抗原を認識する抗体が固相担体上に捕捉されます。目的の抗体の溶出は、多くの場合、グリシンpH 2.8などの低pH緩衝液を用いて行われます。溶出液は、中性トリス緩衝液またはリン酸緩衝液に回収され、低pH溶出緩衝液を中和し、抗体活性の劣化を阻止します。これは、アフィニティー精製を用いて、最初のGST融合タンパク質を精製し、血清から不要な抗GST抗体を除去し、目的の抗体を精製する良い例です。

モノクローナル抗体は、タンパク質に非常に特異的に結合するように選択することもでき、その場合、タンパク質は比較的穏やかな条件下で放出されます。これは、将来のさらなる研究に役立つ可能性があります。^{[ 14 ]}

ペプチド抗原に対する抗体を精製するために、簡略化された戦略がよく用いられる。ペプチド抗原を合成的に作製する場合、ペプチドのN末端またはC末端に末端システイン残基を付加する。このシステイン残基にはスルフィドリル官能基が含まれており、これによりペプチドをキャリアタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH））に容易に結合させることができる。同じシステイン含有ペプチドは、システイン残基を介してアガロース樹脂に固定化され、その後、抗体の精製に用いられる。

ほとんどのモノクローナル抗体は、細菌由来の免疫グロブリン特異的タンパク質Aまたはタンパク質Gに基づくアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製されている。 ^{[ 15 ]}

モノリシックカラムに固定化されたモノクローナル抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーは、EVの表面に存在するテトラスパニンやインテグリンを標的とすることで、ヒト血漿から細胞外小胞（例えば、エクソソームやエクソマー）を捕捉するために成功裏に使用されてきた。^{[ 16 ] [ 17 ]}

免疫親和性クロマトグラフィーは、患者ケアにおける迅速な診断手段を提供する免疫クロマトグラフィー検査（ICT）ストリップの基礎でもあります。ICTを使用すると、検査技師は検査室を必要とせずに患者のベッドサイドで判定を行うことができます。^{[ 18 ]} ICT検出は、感染症を引き起こす微生物に対して非常に特異的です。^{[ 19 ]}

免疫親和性クロマトグラフィーは、抗体機能化固定相を用いて、リンパ球や特定のタンパク質などの血液由来成分を選択的に分離するために応用されてきた。^{[ 20 ]}血液痕の付着からの時間（TSD）を推定するためのルーチン法ではないが、TSD研究で使用される標的分子分析（プロテオミクス、メタボロミクス、核酸プロファイリングなど）では、低存在量のバイオマーカーの感度を向上させるために、免疫親和性に基づく濃縮ステップが組み込まれている可能性がある。^{[ 21 ] [ 22 ]}抗体ベースの検出法は、法医学血清学でも血液を識別し、基質上での時間の経過に伴う血液の持続性を評価するために使用されており、法医学体液分析における免疫学的特異性のより広範な役割を示している。^{[ 23 ]}

固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）は、アミノ酸、特にヒスチジンと金属との特異的な配位共有結合に基づいています。この技術は、金属イオンに対する親和性を持つタンパク質を、固定化された金属イオンを含むカラムに保持させることで機能します。例えば、ヒスチジン含有タンパク質やペプチドの精製にはコバルト、ニッケル、銅、リン酸化タンパク質やペプチドの精製には鉄、亜鉛、ガリウムなどが用いられます。多くの天然タンパク質は金属イオンに対する親和性を持たず、そのため、組換えDNA技術を用いて、関連する遺伝子にそのようなタンパク質タグを導入することができます。目的のタンパク質を溶出させる方法としては、pHの変更や、イミダゾールなどの競合分子の添加などが挙げられます。^{[ 24 ] [ 25 ]}

アフィニティークロマトグラフィーの最も一般的な用途は、組換えタンパク質の精製です。既知のアフィニティーを持つタンパク質は、精製を容易にするためにタンパク質タグが付けられます。タンパク質は、アフィニティー結合を選択できるように遺伝子改変されている場合があり、これは融合タンパク質として知られています。タンパク質タグには、ヘキサヒスチジン（His）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、およびコリシンE7変異体CL7タグなどがあります。ヒスチジンタグは、固定相に組み込まれたキレート剤と配位共有結合を形成することによって固定化されたニッケル、コバルト、亜鉛、銅、鉄イオンに対する親和性を持っています。溶出には、イミダゾールなどの金属イオン配位子として作用できる化合物の過剰量が使用されます。GSTはグルタチオンに対する親和性を持ち、市販のグルタチオンアガロースとして固定化されています。溶出中、過剰量のグルタチオンを使用してタグ付きタンパク質を置換します。 CL7は免疫タンパク質7（Im7）に対する親和性と特異性を持ち、Im7アガロース樹脂として市販されている。溶出には、活性部位特異的プロテアーゼをIm7樹脂に適用して、タグのないタンパク質を遊離させる。^{[ 26 ]}

レクチンアフィニティークロマトグラフィーは、レクチンを用いてサンプル中の成分を分離するアフィニティークロマトグラフィーの一種です。コンカナバリンAなどのレクチンは、特定のα-D-マンノースおよびα-D-グルコース糖分子に結合できるタンパク質です。レクチンアフィニティークロマトグラフィーで使用される一般的な糖分子には、Con A-セファロースやWGA-アガロースなどがあります。^{[ 27 ]}レクチンの別の例としては、DN-アセチルグルコサミンに結合するコムギ胚芽凝集素があります。^{[ 28 ]}最も一般的な用途は、糖タンパク質を非糖化タンパク質から分離すること、またはある糖鎖型を別の糖鎖型から分離することです。^{[ 29 ]}レクチンアフィニティークロマトグラフィーを実行する方法は様々ですが、目的は目的のタンパク質の糖リガンドを抽出することです。^{[ 27 ]}

アフィニティークロマトグラフィーのもう1つの用途は、特定のタンパク質に特有のゲルマトリックスを使用して特定のタンパク質を精製することです。たとえば、大腸菌β-ガラクトシダーゼの精製は、アフィニティーマトリックスとしてp-アミノベニル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシルアガロースを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって行われます。p-アミノベニル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシルアガロースは、大腸菌β-ガラクトシダーゼの良好な基質アナログとして機能するガラクトピラノシル基を含むため、アフィニティーマトリックスとして使用されます。この特性により、酵素はアフィニティーマトリックスの固定相に結合し、β-ガラクトシダーゼはカラムに塩の濃度を上げて添加することによって溶出されます。^{[ 30 ]}

アルブミンとマクログロブリンの混入物のアフィニティー精製は、質量分析を行う際に、過剰なアルブミンとα2-マクログロブリンの混入物を除去するのに役立ちます_{。血清アルブミンのアフィニティー精製では、血清タンパク質を収集または吸着するために使用される固定相として、シバクロンブルーセファロースを使用できます。その後、}チオシアン酸塩（SCN− ^）を含む緩衝液を使用して、血清タンパク質を吸着剤から溶出できます。 ^{[ 32 ]}