色素リガンドアフィニティークロマトグラフィー

色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーは、複雑な混合物のタンパク質精製に使用されるアフィニティークロマトグラフィー技術の 1 つです。一般的なクロマトグラフィーと同様ですが、カラムの支持マトリックス上に固定相として色素を適用し、類似の活性部位を持つさまざまなタンパク質が結合できるようにするため、擬似アフィニティーと呼ばれます。 ^[1]合成色素は、タンパク質の活性部位に結合する基質または補因子を模倣するために使用され、さらに強化してより特定のタンパク質をターゲットにすることができます。その後、洗浄、つまり他の非ターゲット分子を除去するプロセスが続き、次に pH を変更するか塩濃度を操作することでターゲットタンパク質を溶出します。固定化色素の安定性により、カラムは何度も再利用できます。充填カラムとして使用するか、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC) カラムで使用することで、従来の方法で実行できます。^[2]

染料リガンド能の発見は、ブルーデキストランと呼ばれる青色染料によるものである。青色染料は、ゲル濾過カラムの空隙容積（V ₀）マーカーとして使用される。この染料は、ピルビン酸キナーゼなどの特定のタンパク質に結合し、空隙容積とともに溶出する性質があることが示された。その後、デキストランに結合する反応性染料「シバクロンブルーFG3-A」が、タンパク質との相互作用の原因であることが判明した。^{[1] [2]}

染料は通常モノクロロトリアジン環またはジクロロトリアジン環（トリアジン染料）に結合するため、カラムマトリックス上に効果的に固定化されます。このタイプの染料は、ヒドロキシル基を持つ支持マトリックス上で特によく機能します。^[3]一般的に使用される支持マトリックスは、架橋アガロース（セファロース）、セファデックス、ポリアクリルアミド、シリカです。

トリアジン結合固定化の例としては、シバクロンブルーFG3-AとセファロースのOH基に共有結合したモノクロロトリアジンからなるブルーセファロースが挙げられる。この反応によりエーテル結合と塩化水素が形成される。^[4]

C ₂₉ H ₂₀ ClN ₇ O ₁₁ S ₃ + C ₂₄ H ₃₈ O ₁₉ → C ₅₃ H ₅₇ N ₇ O ₃₀ S ₃ + HCl

シバクロンブルー FG3-A + セファロース → ブルーセファロース + HCl

このタイプのクロマトグラフィーで使用される染料は、反応染料と呼ばれる繊維産業で生産されるため、安価で一般的に入手可能です。反応染料には、トリアジン環に結合していることが多い発色団が含まれています。繊維産業では、反応染料は綿などのセルロース材料の染色に使用されます。

クロマトグラフィーによく使用される反応性染料は、色指数名または官能基によって分類できます。反応性染料は、各社で商品名が異なり、配合も若干異なることに注意してください。通常、セファロースを支持マトリックスとして充填カラムの形で市販されています。

シバクロンブルーF3GA、プロシオンブルーHB、またはリアクティブブルー2は、P2Yプリン受容体などのプリン受容体拮抗薬であり、ATP受容体チャネル拮抗薬でもあります。化学式はC ₂₉ H ₂₀ ClN ₇ O ₁₁ S ₃で、分子量は774.2 g/molです。^[5]シバクロンブルーは水とDMSOに溶けますが、エタノールには溶けません。水中では、超音波処理により12.92 mMで飽和濃度に達します。シバクロンブルーF3GAは、ヌクレオチド結合タンパク質に対する幅広い特異性、または単に立体選択性静電結合を持っています。インターフェロン、脱水素酵素、キナーゼ、血清アルブミンの精製に使用できます。例えば、支持マトリックスであるポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）上でCibacron Blue F3G-Aを使用して、クライオゲルの形でヒト歯肉線維芽細胞抽出物からインターフェロンを精製した。インターフェロンの純度は97.6%であることが示された。^[6]

ブルーMX-Rまたはリアクティブブルー4の化学式はC ₂₃ H ₁₄ Cl ₂ N ₆ O ₈ S ₂で、分子量は637.4 g/molです。シバクロンブルーF3GAとは異なり、発色団にジクロロトリアジン環が含まれています。大規模なタンパク質精製では、ブルーMX-Rを使用して乳酸脱水素酵素（LDH）などのタンパク質を精製できます。[ ^{2]ポリ（グリシジルメタクリレート-コ-エチレンジメタクリレート）ビーズに固定化されたブルーMX-Rを使用した}高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）では、リゾチームとウシ血清アルブミン（BSA）、精製されたリゾチームをニワトリアルブミンから分離できることが確認されています。^[7]

レッド HE-3B またはリアクティブレッド 120 は、化学式 C ₄₄ H ₃₀ Cl ₂ N ₁₄ O ₂₀ S ₆で、分子量は 1338.1 g/mol で、2 つのモノクロロトリアジン環を含みます。水に非常に溶けやすいです。^[8]レッド HE-3B の脱水素酵素結合能は、NAD+ 依存性脱水素酵素よりも NADP+ 依存性脱水素酵素に対して高く、シバクロンブルー F3G-A の場合はその逆です。^[9]プロシオンレッド HE-3B をセファロースで使用し、60 mM および 150 mM リン酸で溶出させることで、黄色ブドウ球菌からエンテロトキシンA、B、および C _{2 を}精製することができます。 ^[10]

イエローHAまたはリアクティブイエロー3は、化学式C ₂₁ H ₁₇ ClN ₈ O ₇ S ₂で、分子量は593 g/molで、モノクロロトリアジン環を含んでいます。アガロースを支持マトリックスとして、コレステロールエステル転送タンパク質を精製することが確認されています。^[11]

Brown MX-5BRまたはReactive Brown 10は、化学式C ₄₀ H ₁₉ Cl ₄ CrN ₁₂ Na ₂ O ₁₂ S ₂で、分子量は1163.6 g/molで、2つのジクロロトリアジン環を含みます。^[12]たとえば、Brown MX-5BRは、リゾチーム、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼの精製に使用できます。^[13]また、Trpを溶出液として使用してトリプトファニルtRNA合成酵素を溶出できることも示されていますが、Brown MX-5BRを使用して溶出できるt-RNAはトリプトファニルtRNAとチロシルtRNA合成酵素のみです。^[14]