繊維分解細菌は、セルロース分解酵素とヘミセルロース分解酵素を合成する能力によって、複雑な植物多糖類を分解できる微生物群である。多糖類は植物細胞の細胞壁に緻密な繊維状で存在し、主にセルロースとヘミセルロースから構成されている。
セルラーゼに分類される繊維分解酵素は、植物多糖類のβ(1→4)結合を加水分解することができる。セルラーゼとヘミセルラーゼ(キシラナーゼとも呼ばれる)は、これらの酵素の代表的な2種類である。
繊維分解細菌は、エネルギーと炭素骨格を得るために、解糖系とペントースリン酸経路を主な代謝経路として炭水化物を異化します 。窒素源としてはアンモニアを主要かつほぼ唯一の供給源とし、発育にはいくつかのビタミンB群を必要とします。また、栄養素の一部を得るために他の微生物に依存することもよくあります。増殖速度は遅いと考えられていますが、イソ酪酸やイソ吉草酸などの短鎖脂肪酸が多量に存在すると増殖が促進されます。これらの化合物は通常、他の微生物のアミノ酸発酵活動の産物として生成されます。生息環境の条件から、ほとんどの繊維分解細菌は嫌気性です。
ほとんどの繊維分解性細菌はバクテロイデス門またはバチルス門に分類され、多様な形態学的および生理学的特徴を持つ複数の細菌種が含まれる。
これらは通常、様々な昆虫や哺乳類と共生関係にある共生種であり、それらの消化管内細菌叢の主要構成要素の一つを構成している。実際、草食動物の場合、ルーメン内容物1ミリリットルあたり、多種多様な属や種の細菌が約5000万個も存在することがある。
さまざまな分野における植物繊維の工業的加工の重要性を考えると、さまざまな動物の消化管内の繊維分解菌群のゲノム解析は、複雑な多糖類(リグノセルロース系バイオマスを含む)の変換のための新しいバイオテクノロジーツールを提供する可能性がある。
これまでのところ、ほとんどの用途では、1種類以上のセルラーゼを含む酵素水溶液が使用されています。工業用酵素の生産は、19世紀末にデンマークと日本で始まりました。酵素は、動物や植物の組織から、あるいは特定の微生物の生物学的活性によって得られる細胞産物です。酵素は、さまざまな工業プロセスで使用されます。工業用途の酵素溶液を製造するには、まず大量の酵素を入手し、次に一定程度まで精製する必要があります。このため、製造プロセスは長く、費用もかかります。代替案の一つとして、微生物群集を利用する方法があり、これによりプロセスが短縮され、コストも削減できます。しかし、細菌群集を利用する場合、酵素溶液を使用する場合よりもプロセス制御がはるかに困難です。
1980年代初頭、繊維分解性細菌が産生する酵素が牛の飼料に添加されるようになりました。これにより、リグノセルロース系物質が部分的に分解され、牛は飼料からより多くのエネルギーを得ることが可能になりました。これらの酵素は、食品加工業界、果物や野菜ジュースの濾過、食用油の抽出、製パンなどにおいて重要性を増しています。さらに、これらの酵素の使用は繊維・洗濯業界にも徐々に拡大し、生地の鮮やかな青色を褪色させ、より色褪せた外観を与えるために使用されています。化学工業では、これらの酵素によって新しい洗剤や食器用洗剤が開発されました。製紙業界では、漂白工程において毒性を最小限に抑え、より経済的に非常に重要な役割を果たしています。また、バイオテクノロジー研究では、繊維分解性酵素のセルロース結合ドメインを利用することで、組換えタンパク質の精製が可能になりました。
繊維分解細菌は、バイオマス分解による再生可能エネルギー生産において重要な役割を果たすと期待されている。バイオテクノロジーの主な目的の一つは、 CO₂排出量を削減することを目的としたバイオ燃料生産である。植物由来のバイオ燃料は、大気中にCO₂を正味で流入させることはないからである。セルロース分解由来のバイオ燃料の燃焼時に放出されるガスは植物の成長過程で再吸収されるため、環境への悪影響はそれほど大きくない。
おそらく、最もよく研究されている繊維分解菌群は反芻動物のルーメン内の菌群でしょう。しかし、昆虫から軟体動物まで、植物繊維を分解できる他の生物も存在し、それらはすべてさまざまな微生物共生体の活動によってそれを行うことができます。植物繊維の工業的変換プロセスと関連する用途を改善するためには、新しい効率的な酵素と特殊な細菌群を発見する必要があります。次に、繊維分解細菌の遺伝子とゲノムの発見における主なステップについて説明します。反芻動物の消化管腔から繊維分解細菌を得るために従える最初のステップは、セルロース含有量の高い飼料(たとえば、Panicum virgatum)を入れたナイロンバッグを牛のルーメン内に導入して、目的の菌群を培養することです。
脊椎に外科的に開口部を作り、タンポンを通して体外からルーメンにアクセスできるようにする。これにより、瘻孔の閉鎖を防ぐことができる。ナイロンバッグをルーメン内で72時間培養する。培養後、植物繊維に付着した微生物とルーメン液中に浮遊している微生物を分離することが重要である。
サンプル中の微生物群集の特異性を分析するには、サンプル中の小サブユニットリボソームRNAの配列の多様性を基準サンプルと比較すればよい。サンプルのDNAを抽出・精製した後、PCRエマルジョン法を用いて小サブユニットリボソームRNAの遺伝子を増幅する。次に、各増幅産物をパイロシークエンシング法で配列決定する。得られた配列は、類似性の程度に応じて比較・分類し、系統発生的に近縁な生物に属する配列のグループであるOTUS(Operational Taxonomic Units)を定義する。2つのサンプルのOTUSを比較することで、両微生物群集の違いを評価できる。
リグノセルロース遺伝子の配列を取得するために、高精度なメタゲノム解析が行われる。試料の全DNAの配列決定とアセンブリによって、試料のメタゲノムが得られる。
線維分解活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の同定は、2つのステップで行われます。まず、バイオインフォマティクス解析を行います。メタゲノム解析で得られた配列を、既知の線維分解タンパク質の遺伝子配列(例えば、炭水化物活性酵素データベース(CAZy)に登録されている配列)と比較します。この最初のステップで候補遺伝子の数が大幅に絞り込まれ、これらの遺伝子が次のステップで使用されます。2番目のステップでは、タンパク質発現用のライブラリーを構築します。発現ベクターを大腸菌に導入し、細菌を培養した後、上清を様々な基質に対する生化学的活性について試験します。
同定された酵素がどの微生物に由来するものかを特定し、メタゲノムアセンブリが正しかったかどうかを確認するために、フローサイトメトリーを用いてサンプルから異なる種類の細菌を分離することができます。蛍光色素で標識された特異抗体を用いることで、異なる系統群に属するサンプル中の様々な細胞型を分離することが可能になります。この技術は蛍光活性化セルソーティング(FACS)と呼ばれます。異なる種類の細菌が分離されたら、それらのゲノムをシーケンスし、メタゲノム解析の妥当性を検証することができます。
参考文献
T. ポンセ・ノヨラ、O. ペレス・アバロス。 Celulasas y xilanasas en la industria.a Departamento de Biotechnología y Bioingeniería del Cinvestav
RL Baldwin、MJ Allison。ルーメン代謝。動物科学ジャーナル 1983年 57:461-477
ムンド・ガナデロ。 El mensual Mundo Ganadero lo edita Eumedia、SA、マドリード。 C/ Claudio Coello、16. 28001 MADRID
「腸内細菌による多糖類の利用:ゲノム解析による新たな知見の可能性」ハリー・J・フリント、エドワード・A・バイヤー、マルコ・T・リンコン、ラファエル・ラメド、ブライアン・A・ホワイト。2008年2月、Nature誌に掲載。