トランスポゾンのシーケンス解析

トランスポゾン挿入シーケンス（Tn-seq）は、トランスポゾン挿入変異誘発とトランスポゾン挿入部位の超並列シーケンス（MPS）を組み合わせて、細菌における目的の機能に関与する遺伝子を同定する手法です。この方法は、もともと4つの研究室で同時並行的に行われた研究により、HITS ^{[ 1 ]} INSeq ^{[ 2 ]} TraDIS ^{[ 3 ]および Tn-Seq [ 4 ]}という略称で確立されました。その後、数多くのバリエーションが開発され、多様な生物系に適用されています。これらの手法は、いずれもDNAシーケンス法によるトランスポゾン挿入変異体の適応度モニタリングを伴うため、総称してTn-Seqと呼ばれることがよくあります^{[ 5 ]}。

トランスポゾンは、ゲノム内で移動できる高度に制御された離散的なDNA断片です。これらは普遍的であり、真正細菌、古細菌、およびヒトを含む真核生物に存在します。トランスポゾンは遺伝子発現に大きな影響を与え、遺伝子機能の決定に使用できます。実際、トランスポゾンが遺伝子に挿入されると、遺伝子の機能が破壊されます。^{[ 6 ]}この特性のため、トランスポゾンは挿入変異誘発に使用できるように操作されてきました。^{[ 7 ]}微生物ゲノムシーケンスの開発は、トランスポゾン変異誘発の使用にとって大きな進歩でした。^{[ 8 ] [ 9 ]}トランスポゾン挿入によって影響を受ける機能は、ゲノムをシーケンスしてトランスポゾン挿入部位を特定することにより、破壊された遺伝子と関連付けることができます。大規模並列シーケンスにより、さまざまな変異体の大きな混合物中のトランスポゾン挿入部位を同時にシーケンスできます。したがって、変異株コレクションにおいてトランスポゾンがゲノム全体に配置されている場合、ゲノムワイド解析は可能である。^{[ 5 ]}

トランスポゾンシーケンス解析では、トランスポゾン挿入ライブラリーの作成が必要であり、このライブラリーには、すべての非必須遺伝子にトランスポゾンが挿入された変異体のグループが含まれます。ライブラリーは、関心のある実験条件下で培養されます。試験条件下での増殖に必要な遺伝子にトランスポゾンが挿入された変異体は、集団内で頻度が減少します。消失した変異体を特定するために、トランスポゾン末端に隣接するゲノム配列がPCRで増幅され、MPSでシーケンス解析されて、各挿入変異の位置と存在量が決定されます。試験条件下での増殖に対する各遺伝子の重要性は、検査対象の条件下での増殖前と増殖後の各変異体の存在量を比較することによって決定されます。Tn-seqは、単一遺伝子の適応度と遺伝子相互作用の両方の研究に役立ちます^{[ 10 ]。}

シグネチャータグ付き変異誘発（STM）は、トランスポゾン挿入変異体をプールして選択的増殖条件下で破壊された遺伝子の重要性を決定する、より古い技術です。^{[ 11 ]} STMのハイスループットバージョンでは、ゲノムマイクロアレイを使用しますが、これは大規模並列シーケンスよりも精度が低く、ダイナミックレンジも狭くなっています。^{[ 5 ]}次世代シーケンスの発明により、ゲノムデータはますます利用可能になりました。しかし、ゲノムデータの増加にもかかわらず、遺伝子機能に関する知識は、遺伝子が果たす役割の理解を制限する要因となっています。^{[ 12 ] [ 13 ]}したがって、Tn-seqのような遺伝子型と表現型の関係を研究するためのハイスループットアプローチが必要でした。

トランスポゾンのシーケンス解析は、バクテリオファージを用いて細菌集団に転移因子を導入することから始まります。Tn-seqは、一般的で安定したトランスポゾンであるHimar I Marinerトランスポゾンを使用します。導入後、DNAは切断され、挿入された配列はPCRによって増幅されます。タイプIIS制限エンドヌクレアーゼであるMmeIの認識部位は、Marinerトランスポゾンの末端反復配列の単一ヌクレオチド置換によって導入できます。^{[ 14 ]}これは、末端反復配列の末尾から4塩基対手前に位置します。

MmeIは、MmeI認識部位から20塩基下流で2塩基対のずれた切断を行う。 ^{[ 15 ]}

MmeIがトランスポゾン挿入変異体のライブラリーからDNAを消化すると、左右のトランスポゾンと周囲のゲノムDNAの16塩基対を含む断片化されたDNAが生成される。16塩基対の断片は、細菌ゲノムにおけるトランスポゾン挿入の位置を決定するのに十分である。アダプター（フローセルに結合するために使用される配列）のライゲーションは、2塩基のオーバーハングによって促進される。アダプターに特異的なプライマーとトランスポゾンに特異的なプライマーを使用して、PCRにより配列を増幅する。120塩基対の産物は、アガロースゲルまたはPAGE精製を使用して分離される。次に、大規模並列シーケンスを使用して、隣接する16塩基対の配列を決定する。^{[ 10 ]}

遺伝子の機能は、特定の条件下で挿入が遺伝子機能に及ぼす影響を調べることによって推測される。

高スループット挿入トラックディープシーケンシング（HITS）やトランスポゾン指向挿入部位シーケンシング（TraDIS）とは異なり、Tn-seqはHimar I Marinerトランスポゾンに特異的であり、他のトランスポゾンや挿入エレメントには適用できません。^{[ 10 ]}ただし、Tn-seqのプロトコルは時間のかからないものです。HITSとTraDISは、さまざまなサイズのPCR産物を生成するDNA断片化技術を使用しており、短いDNAテンプレートが長いテンプレートよりも優先的に増幅される可能性があります。Tn-seqは均一なサイズの産物を生成するため、PCRバイアスの可能性が低減されます。^{[ 10 ]}

Tn-seqは、単一遺伝子の適応度を特定したり、微生物における遺伝子相互作用をマッピングしたりするために使用できます。これらのタイプの研究のための既存の方法は、既存のゲノムマイクロアレイまたは遺伝子ノックアウトアレイに依存していますが、Tn-seqはそうではありません。Tn-seqは大規模並列シーケンスを利用するため、この技術は再現性が高く、感度が高く、堅牢です。^{[ 10 ]}

Tn-seqは、新しい遺伝子機能の特定に有用な技術であることが証明されています。Tn-seqの高感度性により、感度の低い方法では重要でないと判断された表現型と遺伝子型の関係を解明することができます。Tn-seqは、結核菌におけるコレステロール利用に重要な必須遺伝子と経路を特定しました。^{[ 16 ]}

Tn-seqは、遺伝子相互作用を用いて高次ゲノム構造を研究するために使用されてきました。遺伝子は高度に連結されたネットワークとして機能します。したがって、表現型に対する遺伝子の影響を研究するには、遺伝子相互作用も考慮する必要があります。Tn-seqは、 Streptococcus pneumoniaeの5つのクエリ遺伝子と残りのゲノムとの間の相互作用を決定するために使用され、正と負の両方のエピスタシスが明らかになりました。^{[ 4 ] [ 10 ]}

Tn-seqをRNA-seqと組み合わせて使用​​することで、非コードDNA領域の役割を調べることができる。^{[ 17 ]}