トランススプライスエクソン結合RNA末端決定

トランススプライスエクソン結合 RNA 末端決定(TEC-RED) は、SAGEと同様に、メッセンジャー RNA 配列のデジタル検出を可能にするトランスクリプトミクス技術です。SAGE とは異なり、メッセンジャー RNA の 5' 末端からの転写産物の検出と精製には、トランススプライスリーダー配列の存在が必要です。

トランススプライシングの背景

スプライスリーダー配列は、遺伝子自体には見られない、生物で転写されるすべての、または一部のmRNAの5'末端に付加される、非コードRNAの短い配列である。これらは、いくつかの種で、ポリシストロニック転写物を単一遺伝子mRNAに分離する役割を担い、他の種ではモノシストロニック転写物にスプライスする役割を担っていることがわかっている。 ^[1]モノシストロニック転写物に対するトランススプライシングの主な役割は、ほとんどわかっていない。^[2]これらは、独立したタンパク質アイソフォームの組織特異的発現を助ける独立したプロモーターとして機能する可能性があると提案されている。^{[3]スプライスリーダーは、トリパノソーマ類、}ミドリムシ、扁形動物、線虫で確認されている。^[1]^[4]一部の種では、すべてのmRNAに見られるスプライスリーダー配列が1つだけである。C . elegansでは2つが見られ、SL1とSL2とラベルされている。^[5]

TEC-REDメソッド

対象検体から全RNA を精製します。次に、全 RNA からポリ Aメッセンジャー RNA を精製し、逆転写反応を使用してcDNAに変換します。mRNA から生成されたcDNA は、生物のスプライスされたリーダー配列と相同なプライマーを使用してラベル付けされます。9 段階のPCR反応で、cDNA は、プライマーに存在するBpmI制限エンドヌクレアーゼ部位 (クラス IIs 制限エンドヌクレアーゼであればどれでも機能します) とビオチンラベルに同時に埋め込まれます。次に、これらのタグ付きcDNA は、BpmI 制限エンドヌクレアーゼを使用して認識部位から 14 bp 下流で切断され、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化されます。ビオチンラベルを使用して断片をストレプトアビジンマトリックスに結合させることにより、断片はさらに精製され、無関係な DNA 物質から分離されます。次に、6 つの異なる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む 6 つの別々の反応で、アダプター DNA にライゲーションされます。これらのタグは、Bpm1部位をXho1部位に変更するミスマッチを含むプライマーを使用してPCRで増幅されます。アンプリコンは連結され、プラスミドベクターに連結されます。その後、クローンベクターは配列決定され、ゲノムにマッピングされます。^[6]

連結

2004 年に開発されたタグの連結は、SAGE で見られるものとは異なります。Xho1 によるタグの切断とさまざまなサンプルの混合、それに続くライゲーションが、最初の連結ステップを形成します。2 番目のステップでは、3' 末端に付着したアダプター分子にコンセンサスを持つ制限エンドヌクレアーゼの 1 つを使用します。これらは再びライゲーションされ、PCRが実行されて次の連結のためにサンプルが精製されます。連結は 2 番目の制限エンドヌクレアーゼで続けられ、続いて 3 番目、最後に 4 番目の制限エンドヌクレアーゼが続きます。これにより、Xho1 部位の周囲 5' から 5' に配置された 32 個のタグを含む 6 つのエンドヌクレアーゼライゲーションによって形成されたコンカタマーが生成されます。 ^[6] SAGE では、PCR によってジタグが形成され増幅された後に連結が行われます。ジタグの外側にあるリンカーは、結合を提供する酵素によって切断され、これらの粘着末端ジタグはランダムに連結され、クローニングベクターに配置されます。^[7]

利点

TEC-RED が SAGE より優れている点は、最初のリンカー結合に制限エンドヌクレアーゼが必要ないことです。これにより、SAGE で見られるように、一部の遺伝子から欠落する制限部位配列に関連するバイアスが防止されます。特定の RNAアイソフォームのスナップショットを取得できるため、プロモーターの代替選択によるアイソフォームの差別的調節を推測できます。^[8]これは、SL1 または SL2 配列に固有の発現パターンの識別にも役立ちます。TEC-RED では、生成された RNA の 5' 末端、つまりアミノ末端スプライシングによって異なるアイソフォームの特性評価も可能になります。この技術により、予測される可能性のあるすべての既知および未知の遺伝子、および生成される可能性のある 5' スプライスアイソフォームまたは 5' RNA 末端の決定と検証が可能になります。TEC-RED を SAGE または修正されたプロトコルと組み合わせて使用すると、転写産物の 5' 末端と 3' 末端をそれぞれ識別できます。したがって、トランススプライスされたリーダー配列を含む選択的スプライスバリアントの識別、および場合によっては相対的な量を特定することが可能になります。

バリエーション

トランススプライスされたリーダー配列を持たない生物の 5' タグ解析を可能にする 2 つの代替技術が発表されている。Toshiyuki らと Shin-ichi らが発表した技術は、それぞれ CAGE と 5' SAGE と呼ばれている。CAGE は、ビオチン化キャップトラッパー技術を利用して、5 ' 末端にアダプター配列が連結された完全長cDNA を作成して選択するのに十分な長さの mRNA シグナルを維持する。5' SAGE はオリゴキャッピング技術を利用する。 ^{[9]どちらも、}cDNA の作成後にアダプター配列を使用してプライミングする。ただし、これらの方法にはどちらも欠点がある。CAGE は、最初の位置にグアニンが追加されたタグを示しており、オリゴキャッピングは RNA リガーゼの使用により配列バイアスにつながる可能性がある。^[10]

参照

参考文献

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外部リンク

CAGE タグ http://genome.gsc.riken.jp/absolute/
5' SAGE 結果 https://archive.today/20040821030224/http://5sage.gi.ku-tokyo.ac.jp/" https://archive.today/20040821030224/http://5sage.gi.ku-tokyo.ac.jp/
wormbase で見られる TEC RED タグ https://web.archive.org/web/20080909025225/http://www.wormbase.org/db/searches/advanced/dumper

[Riddle97-1] リドル、ドナルド L. (1997). C. elegans II. プレインビュー、ニューヨーク: コールドスプリングハーバー研究所出版. ISBN 978-0-87969-532-3。

[2] Lall S、Friedman CC、Jankowska-Anyszka M、Stepinski J、Darzynkiewicz E、Davis RE (2004 年 10 月)。「Ascaris suum 胚無細胞系における線虫翻訳へのトランススプライシング、5' リーダー長、キャップポリ (A) 相乗効果、および開始因子の寄与」。J . Biol. Chem . 279 (44): 45573–85. doi : 10.1074/jbc.M407475200 . PMID 15322127。

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