Loading article…
スピンカラムを用いた核酸精製法は、核酸を迅速に精製するための固相抽出法である。この方法は、核酸が特定の条件下でシリカの固相に結合するという性質を利用している。
この方法のさまざまな段階は、溶解、結合、洗浄、および溶出です。[ 1 ] [ 2 ]より具体的には、標的細胞を溶解して核酸を放出し、シリカ膜に核酸を選択的に結合し、シリカ膜に結合していない粒子や阻害物質を洗浄し、核酸を溶出することで、最終的に精製された核酸が水溶液として得られます。
細胞溶解を行うには、試料中の細胞（血液、組織など）の細胞膜を破壊し、核酸を遊離させるための処理が必要です。対象となる物質に応じて、界面活性剤やその他の緩衝液の使用、プロテアーゼやその他の酵素の使用、様々な時間や温度での加熱、あるいはナイフやホモジナイザーによる切断、乳鉢と乳棒の使用、ビーズミルによるビーズ破砕といった機械的破壊などが含まれます。
結合を行うため、溶解したサンプルに緩衝液とエタノールまたはイソプロパノールを加えます。結合溶液中のサンプルをスピンカラムに移し、カラムを遠心分離機にセットするか、真空装置に接続します。遠心分離機または真空装置によって、溶液はスピンカラム内部のシリカ膜を通過します。適切なイオン条件下では、残りの溶液が通過する間に、核酸がシリカ膜に結合します。目的物質が結合したら、通過液を取り除くことができます。
洗浄するには、カラムに新しいバッファーを加え、膜を通して遠心分離または真空吸引します。このバッファーは、結合塩やその他の残留汚染物質を除去しながら、結合条件を維持することを目的としています。通常、シリカ膜上の核酸から汚染物質がなくなるまで、エタノール/イソプロパノールの濃度を徐々に上げて、数回の洗浄が必要です。最後の「洗浄」は、アルコールを蒸発させるための乾燥工程であることが多く、精製された核酸のみがカラムに結合した状態で残ります。
最後に、溶出とは、カラムに水溶液を添加し、親水性核酸をカラムから溶出させて溶液に戻すプロセスです。この工程は、塩、pH、時間、または加熱によって効率化できます。最後に、溶出液を回収するために、カラムをきれいなマイクロチューブに移し、遠心分離を行います。
今日用いられている核酸分析法よりも前から、ヨウ化ナトリウムや過塩素酸ナトリウムなどのカオトロピック剤が存在すると、DNAはシリカ、ガラス粒子、またはシリカで細胞壁を覆う珪藻と呼ばれる単細胞藻類に結合することが知られていました。この性質は、アルカリ条件下でガラス粉末またはシリカビーズを使用して核酸を精製するために利用されました。[ 3 ]これは後に、カオトロピック剤としてチオシアン酸グアニジンまたは塩酸グアニジンを使用することで改良されました。 [ 4 ] 取り扱いの容易さから、後にガラスビーズの使用はシリカカラムに変更されました。また、自動抽出装置の使用を可能にするために、シリカコーティングされた常磁性ビーズ、より一般的には「磁気ビーズ」抽出と呼ばれるものが開発されました。