ファージ支援による連続進化

ファージ支援連続進化( PACE ) は、タンパク質の自動誘導進化のためのファージベースの技術です。これは、標的タンパク質の望ましい活性と、そのタンパク質に対応する遺伝子を運ぶ感染性バクテリオファージの適応度との関連に依存しています。したがって、望ましい活性が大きいタンパク質は、そのキャリアファージに高い感染性を与えます。感染性の高いファージはより効果的に増殖し、有利な突然変異を選択します。遺伝的変異は、ファージベクター上のエラーを起こしやすいポリメラーゼを使用して生成され、時間の経過とともにタンパク質に有益な突然変異が蓄積されます。この技術は、人間の介入を最小限に抑えながら何百回もの選択を実行できることで知られています。

PACE の中心となる構成要素は、「ラグーン」と呼ばれる固定容量の容器です。ラグーンには、目的の遺伝子 (選択プラスミド、または SP と呼ばれる) を運ぶM13 バクテリオファージベクターと、ファージの複製を可能にする宿主である大腸菌細胞が含まれています。ラグーンは、大腸菌細胞を含む液体培地の追加と排出によって常に希釈されます。液体の流量は、希釈率が大腸菌の増殖速度よりも速く、ファージの増殖速度よりも遅くなるように設定されます。したがって、ラグーンには常に新鮮な大腸菌細胞が供給されますが、ファージは十分に速い複製によってのみ保持されます。^[1]

ファージの複製には大腸菌の感染が必要であり、M13ファージの場合、タンパク質III（pIII）に依存します。^[2] PACEを使用する場合、ファージベクターにはpIIIを生成する遺伝子がありません。代わりに、pIIIの生成は、ユースケースごとに異なるメカニズムを介して目的のタンパク質の活性と結びついており、多くの場合、アクセサリプラスミドまたはAPと呼ばれるpIII発現遺伝子III（gIII）を含む追加のプラスミドが関係します。注目すべきことに、感染性ファージの生成はpIIIの生成に比例します。 ^[3]したがって、タンパク質の活性が高いほど、pIIIの生成率が高くなり、その特定の遺伝子に対してより感染性の高いファージが生成されます。

エラーを起こしやすいポリメラーゼ（突然変異誘発プラスミド、または MP にコード化されている）を使用して、遺伝的変異がファージベクターのタンパク質遺伝子部分に導入されます。ラグーンの絶え間ない排水によって適用される選択圧により、十分な速さで複製できるファージのみがラグーンに保持されるため、時間の経過とともに、ラグーンで複製するファージに有益な突然変異が蓄積されます。このようにして、進化のラウンドが継続的に実行され、人間の介入をほとんど必要とせずに数百ラウンドが経過します。^[1]

この技術の先駆者である最初の論文では、T7 RNAポリメラーゼは、T3やSP6プロモーターなどの異なるプロモーターを認識するように進化しました。 ^[4]これは、ターゲットプロモーターをgIIIの唯一のプロモーターにすることで実現しました。^[5]そのため、目的のプロモーターに対する特異性が高い変異ポリメラーゼは、より多くのpIIIを生成しました。その結果、元のT3プロモーターよりもターゲットプロモーターに対して約3〜4桁高い活性を持つポリメラーゼが生まれました。^[4] この元のPACEシステムは正の選択のみを実行しましたが、負の選択も可能にするバリアントが開発されました。これは、望ましくない活性を非機能的なpIIIの生成に結び付けることで行われ、これにより感染性ファージの生成量が減少します。^[6]

プロテアーゼは、 PACE を用いてさまざまなペプチドを切断するように進化してきました。これらのシステムでは、目的のプロテアーゼ切断部位を使用して、T7 RNA ポリメラーゼと T7リゾチームをリンクします。T7 リゾチームは、T7 ポリメラーゼが gIII を転写するのを防ぎます。ペプチドリンカーが切断されると、T7 ポリメラーゼが活性化され、pIII 遺伝子の転写が可能になります。この方法は、大幅に異なるペプチド基質を持つTEV プロテアーゼを作成するために使用されました。 ^{[6] [7]}

PACE を利用して、非標準アミノ酸用のアミノアシル tRNA 合成酵素(aaRS) も開発されました。aaRS の活性は、gIII の途中に TAG 終止コドンを追加することで pIII の生成と関連しています。TAG コドンのサプレッサー tRNA をアミノアシル化する合成酵素は終止コドンの活性を抑制し、機能的な pIII の生成を可能にします。このシステムを使用して、非標準アミノ酸p-ニトロフェニルアラニン、ヨードフェニルアラニン、Boc-リジンを利用する aaRS が開発されました。 ^[8]

タンパク質間相互作用もPACEを使用して進化させられてきた。このスキームでは、標的タンパク質はDNA結合タンパク質と融合され、これはgIIIプロモーターの上流に配置された標的配列に結合する。進化中のタンパク質はRNAポリメラーゼと融合される。タンパク質間相互作用が良好であればあるほど、pIIIの転写がより多く起こり、PACE条件下でタンパク質間相互作用の進化が可能になる。^[6]この方法は、昆虫毒素耐性を克服できるバチルス・チューリンゲン シスエンドトキシン変異体を進化させるために使用された。 ^{[6] [9]}

PACE は、より可溶性の発現のためにAPOBEC1 を進化させるために使用されました。APOBEC1 はシチジン脱アミノ酵素であり、塩基編集において単一ヌクレオチド編集 C-->T を触媒する用途が見つかりました。^[10]大腸菌では、APOBEC1 は通常、溶液から不溶性画分に落ちます。^[11] APOBEC1 をより可溶性の発現のために進化させるために、T7 ポリメラーゼの N 末端を APOBEC1 に融合し、ポリメラーゼの残りの部分を別途発現させました。T7 ポリメラーゼは、N 末端部分がポリメラーゼの残りの部分に結合できる場合にのみ機能します。APOBEC1 は、N 末端部分が正しく露出されるように適切に折り畳まれている必要があるため、T7 ポリメラーゼの活性は APOBEC1 の折り畳みと相関しています。次のように、pIII の転写と生成は、T7 ポリメラーゼを介して APOBEC1 の可溶性発現とリンクしています。このアプローチを用いることで、APOBEC1の可溶性発現は機能に変化なく4倍に増加した。^{[7] [9]}

PACE は、より触媒活性の高いデオキシアデノシンデアミナーゼの作成にも使用されました。デオキシアデノシンデアミナーゼは、塩基エディターで A->T の単一ヌクレオチド編集を実行するために使用されます。これは、 T7 ポリメラーゼの遺伝子にアデノシンを含む終止コドンを配置することによって行われました。塩基エディターがエラーを修正できれば、機能的な T7 ポリメラーゼが生成され、pIII の生成が可能になります。このシステムを使用して、野生型と比較して 590 倍の活性を持つデオキシアデノシンデアミナーゼが進化しました。^[12]