ペプチドマイクロアレイ

ペプチドマイクロアレイ（ペプチドチップまたはペプチドエピトープマイクロアレイとも呼ばれる）は、通常はガラスまたはプラスチックのチップである固体表面上に表示されるペプチドのコレクションです。ペプチドチップは、生物学、医学、薬理学の科学者が結合特性、機能性、およびタンパク質間相互作用全般の速度論を研究するために使用されています。基礎研究では、ペプチドマイクロアレイは、酵素（キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素など）のプロファイル作成、抗体エピトープのマッピング、またはタンパク質結合の重要な残基の検出によく使用されます。実際の用途としては、血清マーカーの発見、疾患進行中の個々の患者の変化する体液性免疫応答のプロファイリング、治療介入のモニタリング、患者の層別化、診断ツールおよびワクチンの開発などがあります。

ペプチドマイクロアレイのアッセイ原理は、ELISAプロトコルに似ています。ペプチド（数万個まで、複数のコピー）は、通常、顕微鏡スライドと同じサイズと形状のガラスチップの表面に結合します。このペプチドチップは、精製酵素や抗体、患者または動物の血清、細胞溶解物などのさまざまな生物学的サンプルと直接インキュベートし、結合したタンパク質または修飾基質を標的とする一次抗体など、ラベル依存的な方法で検出できます。数回の洗浄ステップの後、必要な特異性を持つ二次抗体（例：抗IgGヒト/マウス、抗リン酸化チロシン、抗myc）を適用します。通常、二次抗体は蛍光スキャナーで検出できる蛍光ラベルでタグ付けされます。^[2]その他のラベル依存検出方法には、化学発光、比色定量、またはオートラジオグラフィーがあります。

ラベル依存性アッセイは迅速かつ簡便に実施できるが、偽陽性や偽陰性の結果が生じるリスクがある。^[3]最近では、表面プラズモン共鳴（SPR）分光法、質量分析（MS）やその他の多くの光学バイオセンサー^{[4] [5] [6] [7]}を含むラベルフリー検出が、広範囲の酵素活性の測定に使用されている。^[8]

ペプチドマイクロアレイは、タンパク質マイクロアレイに比べていくつかの利点があります。

• 合成の容易さとコスト
• 長期保存安定性
• エピトープレベルでの結合イベントの検出により、エピトープ拡散の研究が可能になる
• ペプチド配列（翻訳後修飾、配列多様性、非天然アミノ酸など）および固定化化学の柔軟な設計
• バッチ間の再現性の向上

ペプチドマイクロアレイは、ペプチドがスポットされた平面スライド、またはin-situ合成によって表面に直接組み立てられたスライドです。スポットされたペプチドは、スポット前に質量分析計による分析や濃度の標準化などの品質管理を受けることができ、単一の合成バッチから得られますが、表面で直接合成されたペプチドはバッチ間のばらつきや品質管理オプションの制限を受ける可能性があります。ただし、チップ上のペプチド合成では、数万のペプチドを並行して合成できるため、合成コストが低く、ペプチドライブラリが大きくなります。 ^[9]ペプチドは、理想的には化学選択的結合を介して共有結合し、相互作用プロファイリングのために同じ方向のペプチドになります。いくつかの代替手順では、非特異的な共有結合と接着固定について説明します。

しかし、リソグラフィー法を使用すれば、カップリングサイクル数が多すぎるという問題を克服することができます。レーザー印刷によるマイクロチップ上へのペプチドアレイのコンビナトリアル合成が報告されており、^{[9] [10]}、改良されたカラーレーザープリンターが従来の固相ペプチド合成化学と組み合わせて使用​​されています。 ^[11]アミノ酸はトナー粒子内に固定化され、ペプチドは連続したコンビナトリアル層でチップ表面に印刷されます。カップリング反応の開始時にトナーが溶けることで、アミノ酸の送達とカップリング反応を独立して実行できます。この方法のもう1つの利点は、各アミノ酸を個別に生成して精製し、その後トナー粒子に埋め込むことができるため、長期保存が可能になることです。

ペプチド マイクロアレイは、さまざまな種類のタンパク質間相互作用、特にペプチド認識モジュールまたは最も一般的にはタンパク質相互作用ドメインと呼ばれるモジュール式タンパク質サブ構造を含む相互作用を研究するために使用できます。その理由は、このようなタンパク質サブ構造は、結合パートナーの本来構造化されていない領域に露出していることが多い短い線状モチーフを認識するため、ペプチドをプローブとして、ペプチド認識モジュールを分析対象として、相互作用をin vitro でモデル化できるからです。ほとんどの出版物は、免疫モニタリングと酵素プロファイリングのコンテキストで見つかります。

• 抗原または全プロテオームにおける免疫優勢領域のマッピング^{[12] [13] [14] [15]}
• 血清マーカーの発見^{[16] [17]}
• 臨床試験のモニタリング^[18]
• 抗体シグネチャのプロファイリング^{[19] [20]}とエピトープマッピング
• 中和抗体の発見^[21]

• 孤児酵素の基質の同定^[22]
• 既知の酵素基質の最適化^[23]
• シグナル伝達経路の解明^[24]
• 汚染酵素活性の検出
• コンセンサス配列とキー残基の決定^[25]
• 複合体内のタンパク質間相互作用部位の特定^[26]

データの解析と結果の評価は、あらゆるマイクロアレイ実験において最も重要な部分です。^[27]マイクロアレイスライドをスキャンした後、スキャナーは 20 ビット、16 ビット、または 8 ビットの数値画像をタグ付き画像ファイル形式 (*.tif) で記録します。.tif 画像により、スキャンしたマイクロアレイスライド上の各蛍光スポットの解釈と定量化が可能になります。この定量データは、マイクロアレイスライド上で測定された結合イベントまたはペプチド修飾に関する統計解析を行うための基礎となります。検出されたシグナルの評価と解釈のためには、ペプチドスポット (画像内に表示されます) と対応するペプチド配列の割り当てを行う必要があります。割り当てのデータは通常、GenePix Array List (.gal) ファイルに保存され、ペプチドマイクロアレイと一緒に提供されます。.gal ファイル (タブ区切りのテキストファイル) は、マイクロアレイ定量化ソフトウェアモジュールを使用して開くことも、テキストエディター (メモ帳など) または Microsoft Excel で処理することもできます。この「gal」ファイルは、ほとんどの場合、マイクロアレイ製造元によって提供され、マイクロアレイ製造を行うロボットに組み込まれた入力 txt ファイルと追跡ソフトウェアによって生成されます。