蛍光分光法

蛍光分光法（蛍光測定法または分光蛍光測定法とも呼ばれる）は、サンプルからの蛍光を分析する電磁分光法の一種です。通常は紫外線である光線を使用して、特定の化合物の分子内の電子を励起し、光を放出させます。通常は可視光ですが、必ずしもそうとは限りません。補完的な技術として吸収分光法があります。単一分子蛍光分光法の特殊なケースでは、放出された光の強度変動が単一の蛍光体または蛍光体のペアから測定されます。

蛍光を測定する装置は蛍光計と呼ばれます。

分子にはエネルギー準位と呼ばれる様々な状態があります。蛍光分光法は主に電子状態と振動状態に関係しています。一般的に、検査対象となる種には、対象となる基底電子状態（低エネルギー状態）と、より高いエネルギーの励起電子状態があります。これらの電子状態のそれぞれには、様々な振動状態があります。^[1]

蛍光では、まず光子を吸収して、分子が基底電子状態から励起電子状態のさまざまな振動状態のいずれかに励起されます。他の分子との衝突により、励起分子は励起電子状態から最低の振動状態に達するまで振動エネルギーを失います。このプロセスは、多くの場合、ヤブロンスキー図で視覚化されます。^[1]

その後、分子は再び基底電子状態のさまざまな振動レベルの 1 つに落ち、その過程で光子を放出します。^[1]分子は基底状態のいくつかの振動レベルのいずれかに落ちる可能性があるため、放出された光子は異なるエネルギーを持ち、したがって周波数も異なります。したがって、蛍光分光法で放出される光のさまざまな周波数とその相対的な強度を分析することで、さまざまな振動レベルの構造を決定できます。

原子種の場合、プロセスは同様ですが、原子種は振動エネルギーレベルを持たないため、放出される光子は入射光と同じ波長であることが多いです。吸収された光子を再放出するこのプロセスは「共鳴蛍光」であり、原子蛍光の特徴ですが、分子蛍光でも見られます。^[2]

一般的な蛍光 (発光) 測定では、励起波長は固定され、検出波長は変化しますが、蛍光励起測定では、検出波長は固定され、励起波長は対象領域全体で変化します。発光マップは、励起波長の範囲から生じる発光スペクトルを記録し、それらをすべて組み合わせることで測定されます。これは、励起波長と発光波長の関数としての発光強度を表す 3 次元表面データ セットであり、通常は等高線マップとして表されます。

一般的に、フィルターを使用して入射光と蛍光を分離するフィルター蛍光計と、回折格子モノクロメータを使用して 入射光と蛍光を分離する分光 蛍光計の 2 種類の機器があります。

どちらのタイプも、次の方式を採用しています。励起源からの光がフィルターまたはモノクロメーターを通過し、サンプルに当たります。入射光の一部はサンプルに吸収され、サンプル内の分子の一部が蛍光を発します。蛍光は全方向に放射されます。この蛍光の一部は 2 番目のフィルターまたはモノクロメーターを通過して検出器に到達します。検出器は通常、透過または反射された入射光が検出器に到達するリスクを最小限に抑えるために、入射光ビームに対して 90° に配置されます。

励起源として、レーザー、LED、ランプなどさまざまな光源を使用できます。特にキセノンアークと水銀灯が適しています。レーザーは、通常 0.01 nm 未満の非常に狭い波長間隔でのみ高放射照度の光を放射するため、励起モノクロメータやフィルターは不要です。この方法の欠点は、レーザーの波長をあまり変更できないことです。水銀灯はラインランプであり、ピーク波長付近の光を放射します。対照的に、キセノンアークは、300 ～ 800 nm の範囲でほぼ一定の強度の連続放射スペクトルを持ち、200 nm を少し超える波長まで測定するのに十分な放射照度があります。

蛍光計では、フィルターやモノクロメーターが使用されることがあります。モノクロメーターは、調整可能な波長の光を許容範囲で透過します。最も一般的なタイプのモノクロメーターは回折格子を利用しています。つまり、平行光が格子を照らし、波長に応じて異なる角度で出射します。次に、モノクロメーターを調整して透過する波長を選択できます。異方性測定を可能にするには、2 つの偏光フィルターを追加する必要があります。1 つは励起モノクロメーターまたはフィルターの後、もう 1 つは発光モノクロメーターまたはフィルターの前です。

前述のように、蛍光は励起光に対して 90° の角度で測定されることが最も多い。この形状は、透過した励起光の干渉を避けるために、励起光のラインに 180° の角度でセンサーを配置する代わりに使用される。モノクロメーターは完璧ではなく、迷光、つまり対象以外の波長の光がいくらか透過する。理想的なモノクロメーターは、指定された範囲の光のみを透過し、波長に依存しない高い透過率を持つ。90° の角度で測定する場合、サンプルによって散乱された光のみが迷光を引き起こす。これにより、信号対雑音比が向上し、180° の形状と比較して検出限界が約 10000 倍低下する^[3]。さらに、蛍光は正面から測定することもでき、これは濁ったサンプルや不透明なサンプルでよく行われる。^[4]

検出器は、シングル チャネルまたはマルチ チャネルのいずれかになります。シングル チャネルの検出器は、一度に 1 つの波長の強度しか検出できませんが、マルチ チャネルの検出器は、すべての波長の強度を同時に検出するため、発光モノクロメータやフィルターは不要です。

最も汎用性の高い蛍光計は、デュアルモノクロメータと連続励起光源を備えており、励起スペクトルと蛍光スペクトルの両方を記録できます。蛍光スペクトルを測定する場合、励起光の波長は一定に保たれ、できれば吸収率の高い波長に設定され、発光モノクロメータがスペクトルをスキャンします。励起スペクトルを測定する場合、発光フィルターまたはモノクロメータを通過する波長は一定に保たれ、励起モノクロメータがスキャンします。蛍光強度は吸収に比例するため、励起スペクトルは一般に吸収スペクトルと同一です。^[5]

低濃度では、蛍光 強度は一般に蛍光体の濃度に比例します。

UV/可視分光法とは異なり、デバイスに依存しない「標準」スペクトルは簡単には得られません。いくつかの要因がスペクトルに影響を及ぼし、スペクトルを歪ませるため、「真の」、つまりマシンに依存しないスペクトルを得るには補正が必要です。ここでは、さまざまな種類の歪みを、機器関連またはサンプル関連として分類します。まず、機器から生じる歪みについて説明します。まず、光源の強度と波長特性は、各実験中および各実験間で時間の経過とともに変化します。さらに、すべての波長で強度が一定であるランプはありません。これを補正するには、励起モノクロメータまたはフィルターの後にビームスプリッターを適用して、光の一部を基準検出器に向けます。

さらに、モノクロメータとフィルターの透過効率も考慮する必要があります。これらも時間の経過とともに変化する可能性があります。モノクロメータの透過効率も波長によって異なります。これが、励起モノクロメータまたはフィルターの後にオプションの参照検出器を配置する必要がある理由です。検出器によって検出される蛍光の割合もシステムによって異なります。さらに、検出器の量子効率、つまり検出される光子の割合は、検出器が必然的に劣化するため、波長と時間とともに検出器間で異なります。

考慮すべき他の 2 つのトピックは、放射線を方向付けるために使用する光学系と、サンプル材料を保持または収容する手段 (キュベットまたはセルと呼ばれる) です。ほとんどの UV、可視、および NIR 測定では、精密石英キュベットを使用する必要があります。どちらの場合も、対象の波長範囲で比較的吸収が少ない材料を選択することが重要です。石英は 200 nm ～ 2500 nm を透過するため理想的です。より高品質の石英は 3500 nm まで透過できますが、他の材料の吸収特性によりサンプルからの蛍光がマスクされる可能性があります。

これらすべての機器要因を補正して「標準」スペクトルを得るのは面倒な作業であり、実際には絶対に必要な場合にのみ適用されます。これは、たとえば量子収率を測定する場合や、最も高い発光強度を持つ波長を見つける場合などです。

前述のように、サンプルからも歪みが生じます。したがって、サンプルのいくつかの側面も考慮する必要があります。まず、光分解により、時間の経過とともに蛍光の強度が低下する可能性があります。光の散乱も考慮する必要があります。この文脈で最も重要な散乱の種類は、レイリー散乱とラマン散乱です。レイリー散乱によって散乱された光は入射光と同じ波長ですが、ラマン散乱では散乱光の波長が通常より長波長に変わります。ラマン散乱は、励起光によって引き起こされる仮想電子状態の結果です。この仮想状態から、分子は振動基底状態以外の振動レベルに緩和する場合があります。^[7]蛍光スペクトルでは、励起波数に対して常に一定の波数差で見られます。たとえば、ピークは水中で励起光よりも 3600 cm ⁻¹低い波数で現れます。

考慮すべき他の側面は、内部フィルター効果である。^{[8] [9]}これらには再吸収が含まれる。再吸収は、別の分子または高分子の一部が蛍光体が放射する波長で吸収するために起こる。この場合、蛍光体によって放出された光子の一部またはすべてが再び吸収される可能性がある。別の内部フィルター効果は、蛍光体を含む吸収分子の濃度が高いために起こる。その結果、励起光の強度は溶液全体で一定ではない。その結果、励起光のごく一部だけが検出システムで見える蛍光体に到達する。内部フィルター効果は、放出された光のスペクトルと強度を変えるため、蛍光の発光スペクトルを分析する際には、内部フィルター効果を考慮する必要がある。^{[5] [10]}

折り畳まれたタンパク質の蛍光は、個々の芳香族残基からの蛍光が混ざったものである。折り畳まれたタンパク質の固有の蛍光発光のほとんどはトリプトファン残基の励起によるもので、チロシンとフェニルアラニンによる発光もいくらかあるが、ジスルフィド結合もこの波長域でかなりの吸収を持つ。通常、トリプトファンは最大吸収波長が 280 nm で、発光ピークは溶媒和発色性であり、局所環境の極性に応じて約 300 ～ 350 nm の範囲である^[11]。 したがって、タンパク質の蛍光は、タンパク質の立体配座状態の診断に使用できる。^[12] さらに、トリプトファンの蛍光は、他の残基の近さによって大きく影響される（すなわち、近くのAsp や Glu などのプロトン化された基は、Trp の蛍光を消光する可能性がある）。また、トリプトファンと他の蛍光アミノ酸の間でエネルギー移動が起こる可能性があり、特にフェルスター酸性アプローチを採用する場合、分析に影響を及ぼします。さらに、トリプトファンは比較的希少なアミノ酸であり、多くのタンパク質には 1 個または数個のトリプトファン残基しか含まれていません。したがって、トリプトファン蛍光は、個々のトリプトファン残基の立体配座状態を非常に高感度に測定できます。外因性プローブと比較した利点は、タンパク質自体が変化しないことです。タンパク質立体配座の研究に内因性蛍光を使用することは、実際には、トリプトファン残基が少数 (または 1 個だけ) の場合に限られます。これは、各残基が異なる局所環境にさらされ、異なる発光スペクトルが生じるためです。

トリプトファンは重要な内在蛍光（アミノ酸）であり、トリプトファンの微小環境の性質を推定するために使用できます。変性剤、界面活性剤、またはその他の両親媒性分子を使用して実験を行う場合、トリプトファンの微小環境が変化する可能性があります。たとえば、単一のトリプトファンを「疎水性」コアに含むタンパク質が温度の上昇に伴って変性すると、赤方偏移した発光スペクトルが現れます。これは、トリプトファンが疎水性タンパク質内部ではなく水性環境にさらされているためです。対照的に、水性溶媒にさらされたトリプトファンを含むタンパク質に界面活性剤を添加すると、トリプトファンが界面活性剤小胞またはミセルに埋め込まれている場合は、青方偏移した発光スペクトルが発生します。^{[13]トリプトファンを欠くタンパク質は、}蛍光体に結合する場合があります。

295 nm での蛍光励起では、トリプトファンの発光スペクトルが、より弱いチロシンとフェニルアラニンの蛍光よりも優勢になります。

蛍光分光法は、生化学、医学、化学研究の分野で有機化合物の分析に使用されています。また、皮膚の悪性腫瘍と良性腫瘍の区別にも使用されているという報告もあります。

原子蛍光分光法 (AFS) 技術は、水銀などの重金属の検出に使用される CVAFSなど、空気や水、その他の媒体に存在する化合物の他の種類の分析/測定に役立ちます。

蛍光は光子の方向を変えるためにも使用できます。蛍光ソーラーコレクターを参照してください。

さらに、蛍光分光法は、マイクロ蛍光測定法を使用して顕微鏡レベルに適応することができる。

分析化学では、蛍光検出器がHPLCで使用されます。

水研究の分野では、蛍光分光法は有機汚染物質を検出することで水質を監視するために使用できます。^[14]最近のコンピュータサイエンスと機械学習の進歩により、水の細菌汚染の検出も可能になりました。^[15]

生物医学研究では、蛍光分光法は、蛍光剤を様々な薬剤に架橋させることにより薬剤分布の効率を評価するために使用されています。^[16]

生物物理学的研究における蛍光分光法は、細胞膜内の脂質ドメインを視覚化し、特徴づけることを可能にする。^[17]

• ランタニドプローブ
• 光ルミネセンス
• レーザー誘起蛍光

• Fluorophores.org、蛍光染料のデータベース
• OpenFluor、有機物蛍光のケモメトリック分析をサポートするコミュニティツール
• 写真、活性剤、スペクトルを含む蛍光鉱物のデータベース (fluomin.org)