エピスタシスと機能ゲノミクス

エピスタシスとは、1つの遺伝子の変異が別の遺伝子座の変異の表現型効果を隠す遺伝的相互作用を指す。[1] これらのエピスタシス相互作用を体系的に分析することで、^遺伝子経路の構造と機能についての洞察が得られる。一対の変異から生じる表現型を調べることは、これらの遺伝子の機能がどのように交差するかを理解するのに役立ちます。遺伝的相互作用は一般に、正/緩和または負/悪化のいずれかに分類されます。適応度エピスタシス（非対立遺伝子間の相互作用）は、2つの特定の遺伝子の機能喪失変異が、有害な変異の個々の効果から予測される適応度を超える場合に正（つまり、減少、拮抗、または緩衝）であり、適応度を低下させる場合は負（つまり、強化、相乗、または悪化）です。^{[2] Ryszard KoronaとLukas Jasnosは}、サッカロミセス・セレビシエにおいてエピスタシス効果は通常は正であることを示した。通常、正の相互作用の場合でも、二重変異体は単一変異体よりも適応度が低い。^[2]正の相互作用は、両方の遺伝子が同じ経路内にある場合によく発生する。 ^[3]逆に、負の相互作用は、2つの単一変異の場合に予想されるよりもさらに強い欠陥によって特徴付けられ、最も極端な場合（合成病的/致死的）には、二重変異が致死的である。この悪化した表現型は、代償経路の遺伝子が両方ともノックアウトされたときに発生する。

こうしたタイプの相互作用を分析するハイスループット法は、遺伝子相互作用に関する知識を広げるのに役立っています。合成遺伝子アレイ(SGA)、マイクロアレイ上の二倍体ベースの合成致死性分析(dSLAM)、およびエピスタシス ミニアレイ プロファイル(E-MAP) は、遺伝子相互作用の体系的な分析とマッピングのために開発された 3 つの重要な方法です。ゲノム規模でエピスタシスを研究するこの体系的なアプローチは、機能ゲノミクスに大きな影響を及ぼします。これらの方法は、既知の経路内の未知の遺伝子と一連の遺伝子間の負の相互作用と正の相互作用を特定することで、代謝経路または発達経路のコンテキスト内でこれまで特徴付けられていなかった遺伝子の機能を解明できます。

エピスタシス相互作用に関する情報が遺伝子経路とどのように関係しているかを理解するために、C. elegansにおける外陰細胞の分化の簡単な例を考えてみましょう。細胞は Pn 細胞から Pn.p 細胞、VP 細胞、外陰細胞へと分化します。lin-26 の変異^[4]は、Pn 細胞から Pn.p 細胞への分化を阻害します。lin-36 の変異体^[5]も同様に動作し、VP 細胞への移行時に分化を阻害します。どちらの場合も、分化経路の上流でブロックがあるため、結果として生じる表現型は外陰細胞の欠如によって特徴付けられます。これらの遺伝子の両方が破壊された二重変異体は、どちらの単一変異体よりも悪くない同等の表現型を示します。lin-26 の上流の破壊は、lin-36 の変異^[1]の表現型効果を覆い隠し、これは緩和的なエピスタシス相互作用の典型的な例です。

一方、悪化させる突然変異は、各単一突然変異の累積効果よりも悪い表現型を引き起こします。この悪化した表現型は、補償経路に 2 つの遺伝子があることを示しています。単一突然変異体の場合、並行経路が破壊された経路の損失を補償できますが、二重突然変異体の場合、この補償経路の作用も失われ、より劇的な表現型が観察されます。この関係は、より微妙な緩和表現型よりも検出がはるかに容易であり、S. cerevisiae で合成病/致死(SSL) スクリーニングを通じて広範に研究され、成長率が著しく低下した二重突然変異体が特定されています。

二重変異体解析から得られたこれらの結論は、多くの経路や変異体に当てはまるものの、普遍的ではないことを指摘しておく必要がある。たとえば、遺伝子は経路内で反対方向に作用することがあり、両方をノックアウトするとほぼ正常な表現型が生成されるが、各単独の変異体は（反対方向に）深刻な影響を受ける。よく研究されている例として、ショウジョウバエの初期発生中に発生するものがあり、卵子にhunchback遺伝子とnanos遺伝子の遺伝子産物が存在し、反対方向に作用して前後パターンの形成を指示する。シグナル伝達経路でも同様のことがよく起こり、経路の負の調節因子をノックアウトすると過剰活性化表現型が生じ、正に作用する成分をノックアウトすると反対の表現型が生じる。単一の「出力」を持つ線形経路では、反対に作用する 2 つの遺伝子のノックアウト変異が同じ個体で組み合わされている場合、二重変異体の表現型は通常、経路の下流で作用する正常な遺伝子産物を持つ単一変異体の表現型と同じになります。

合成遺伝子アレイ(SGA) とマイクロアレイの二倍体ベースの合成致死性分析 (dSLAM) は、合成の致死性突然変異体を特定し、負のエピスタシス関係を特徴付けるために使用されてきた 2 つの主要な方法です。酵母ゲノム全体の配列決定により、ゲノム内のほぼすべての遺伝子のノックアウト変異体のライブラリを作成できるようになりました。これらの分子バーコード化された変異体は、必要な二重変異体を生成するためにプールして使用できるため、ハイスループットのエピスタシス研究を大幅に促進します。SGA と dSLAM の両方のアプローチは、形質転換/交配によって半数体の二重変異体を生成するこれらの酵母ノックアウト株に依存しています。次に、マイクロアレイ プロファイリングを使用して、これらの単一変異体と二重変異体の適応度を比較します。SGA の場合、検査される二重変異体は半数体であり、変異株と交配した後に収集され、その後数回の選択が行われます。単一変異体と二重変異体の両方の dSLAM 株は、同じ二倍体ヘテロ接合体株 (「dSLAM」の「二倍体」で示される) に由来します。dSLAM 分析の場合、単一変異体と二重変異体の適応度は、成長競合アッセイのマイクロアレイ分析によって評価されます。

遺伝子相互作用をより深く理解するために、実験的アプローチは、野生型または合成致死という表現型の二元分類から移行しつつあります。E-MAP アプローチは、緩和効果と悪化効果の両方を強調できるため特に魅力的であり、この機能が SGA や dSLAM などの他の方法と異なる点です。さらに、E-MAP は両方のタイプの相互作用を識別するだけでなく、これらの相互作用の段階と、各遺伝子ペアに適用される相互作用スコアによって表されるマスクされた表現型の重症度も認識します。

E-MAP は、SGA アプローチを利用して、遺伝子相互作用をハイスループットで解析します。この方法は、S. cerevisiae のエピスタシスを調べるために特に開発されましたが、他のモデル生物にも適用できます。E-MAP は、明確に定義された大規模な遺伝子グループについて、二重変異株の系統的生成から生成されたデータを照合します。各表現型応答は、コロニー サイズを画像化して成長率を決定することによって定量化されます。この適応度スコアは、各単一変異体の予測適応度と比較され、遺伝子相互作用スコアが得られます。 このデータを階層的にクラスタリングして、同様の相互作用プロファイルを持つ遺伝子をグループ化すると、既知の機能を持つ遺伝子と機能を持たない遺伝子の間のエピスタシス関係を識別できます。このようにデータを分類すると、相互作用することがわかっている遺伝子は、同様の相互作用パターンを示すものの機能がまだ特定されていない遺伝子と一緒にクラスタリングされます。したがって、E-MAP データを使用すると、十分に特徴付けられた経路内で遺伝子を新しい機能に配置できます。たとえば、Collins らが発表した E-MAP を考えてみましょう。これは転写伸長因子Dst1 ^[6]を転写調節に関与するメディエーター複合体の中間領域の構成要素と並べてクラスター化している。^[7]これはメディエーターと協調して機能するDst1の新たな役割を示唆している。

特定の E-MAP 内で検査する遺伝子の選択は、実りある結果を得るために重要です。検査する遺伝子の重要なサブセットが文献で十分に確立されていることが特に重要です。したがって、これらの遺伝子は E-MAP のコントロールとして機能することができ、特性が明らかでない遺伝子のデータを解析する際の確実性を高めることができます。細胞内局在および一般的な細胞プロセス (例:細胞周期) 別に編成されたクラスターは、S. cerevisiae で有益な結果をもたらしました。タンパク質間相互作用研究のデータも、E-MAP データ用の遺伝子グループを選択するための有用な基礎となります。物理的相互作用を示す遺伝子は遺伝子レベルでも相互作用を示すことが予想されるため、これらは E-MAP データの適切なコントロールとして機能します。Collins ら (2007) は、大規模アフィニティー精製法(AP-MS) からの E-MAP スコアと物理的相互作用データの比較を行い、そのデータから、E-MAP アプローチは、AP-MS などの従来の方法と同等の特異性でタンパク質間相互作用を識別できることが実証されました。

しかし、エピスタシス関係を調べるハイスループット法は、遺伝子ペアの数が極めて多く（S. cerevisiae では約 2000 万）、遺伝子相互作用の密度がかなり低いため、困難に直面します。^[8]これらの困難は、ゲノム全体のペアを調べるのではなく、単一の遺伝子クラスター内のすべての可能な相互作用を調べることで対処できます。適切に選択すれば、これらの機能クラスターにはゲノムの他の領域よりも大幅に高い遺伝子相互作用の密度が含まれるため、検査する遺伝子ペアの数を大幅に減らしながら、検出率を高めることができます。^[8]

E-MAPのデータを生成するには、何千もの二重変異株を作成する必要があります。たとえば、483の対立遺伝子の研究では、約100,000の異なる二重変異ペアを持つE-MAPが得られました。ただし、これらの変異は致死的な表現型を持つため、必須遺伝子変異体のライブラリの生成は非常に困難です。したがって、E-MAP研究では、これらの遺伝子の発現レベルが中程度の株に依存しています。メッセンジャーRNA摂動による存在量の減少（DAmP）戦略は、この種の分析に必要な変異体のハイスループット生成で特に一般的であり、生存能力を失うことなく必須遺伝子の部分的な破壊を可能にします。^{[9] DAmPは、}抗生物質選択マーカーを終止コドンの下流の3'UTRに組み込むことによってmRNA転写物を不安定化させることに依存しています（図2）。 3' 延長転写産物を持つ mRNA は急速に分解の標的となり、その結果、目的の遺伝子はダウンレギュレーションされますが、その遺伝子は本来のプロモーターの制御下にあります。必須でない遺伝子の場合は、欠失株を使用することができます。欠失部位に分子バーコード (固有の 20 bp 配列) をタグ付けすると、各変異株の相対的な適応度を識別して研究することができます。