コヒーレントラマン散乱顕微鏡

コヒーレント ラマン散乱 (CRS)顕微鏡は、分子のラマン活性振動モードに基づく多光子顕微鏡技術です。CRS 顕微鏡の 2 つの主要な技術は、誘導ラマン散乱 (SRS)とコヒーレント反ストークス ラマン散乱 (CARS)です。SRS と CARS は 1960 年代に理論的に予測され、実験的に実現されました。^{[1] [2] [3]} 1982 年に最初の CARS 顕微鏡が実証されました。^[4] 1999 年に、共線ジオメトリと高開口数対物レンズを使用した CARS 顕微鏡が、ハーバード大学のXiaoliang Sunney Xieの研究室で開発されました。 ^[5]この進歩により、この技術は最新のレーザー走査顕微鏡とより互換性を持つようになりました。^{[6]それ以来、生物医学研究における CRS の人気が高まり始めました。CRS は主に、標識や}染色なしで、生細胞または固定細胞または組織内の脂質、タンパク質、その他の生体分子を画像化するために使用されます。^[7] CRSはラマンタグで標識されたサンプルを画像化するためにも使用することができ、^{[8] [9] [10] 、他の分子からの干渉を避けることができ、通常一般的な生体分子で得られるよりも強いCRS信号を得ることができます。CRSは材料科学[11]}や環境科学^[12]などの他の分野でも応用されています。

コヒーレント ラマン散乱は、ラマン散乱(または自発ラマン散乱)に基づいています。自発ラマンでは、1 つの単色励起レーザーのみが使用されます。自発ラマン散乱の信号強度は、連続波ポンプ レーザーの平均出力に比例して増加します。CRS では、^[7] 2 つのレーザーを使用して、画像化する分子の特定の振動モードを励起します。通常、光子エネルギーが高いレーザーはポンプ レーザーと呼ばれ、光子エネルギーが低いレーザーはストークス レーザーと呼ばれます。信号を生成するには、それらの光子エネルギーの差が振動モードのエネルギーと一致する必要があります。

${\displaystyle E_{ラマン}=E_{ポンプ}-E_{ストークス}}$、

どこで。 ${\displaystyle E_{ラマン}=\hbar \オメガ ,\ E_{ポンプ}=\hbar \オメガ _{ポンプ},\ E_{ストークス}=\hbar \オメガ _{ストークス}}$

CRSは非線形光学プロセスであり、信号レベルは通常、ポンプレーザーとストークスレーザーのパワーの積の関数です。そのため、ほとんどのCRS顕微鏡実験はパルスレーザーで行われ、ピークパワーが高ければCRSの信号レベルが大幅に改善されます。^[13]

CARS では、反ストークス光子 (ポンプよりもエネルギーが高く、波長が短い) が信号として検出されます。

${\displaystyle E_{CARS}=E_{ポンプ}+\オメガ =2\times E_{ポンプ}-E_{ストークス}}$

CARS顕微鏡では、通常、新しく生成された光子を検出する方法が2つあります。1つは前方検出CARS、もう1つはエピ検出CARSと呼ばれます。^{[14] [15]}前方検出CARSでは、生成されたCARS光子がポンプレーザーとストークスレーザーとともにサンプルを通過します。ポンプレーザーとストークスレーザーは、高光学密度（OD）ノッチフィルターによって完全にブロックされます。その後、CARS光子は光電子増倍管（PMT）またはCCDカメラによって検出されます。エピ検出CARSでは、後方散乱したCARS光子は、ダイクロイックミラーまたは偏光ビームスプリッターによって方向を変えられます。高ODフィルターを使用して後方散乱したポンプレーザーとストークスレーザーをブロックした後、新しく生成された光子がPMTによって検出されます。 CARSの信号強度は、ポンプレーザーとストークスレーザーの強度、レーザーの焦点内の分子の数、および分子の3次ラマン感受性と次のような関係があります。 ^[16]${\displaystyle I_{ポンプ},I_{ストークス}}$${\displaystyle N}$${\displaystyle \chi _{ラマン}^{(3)}}$

${\displaystyle I_{CARS}\propto (N\chi _{ラマン}^{(3)})^{2}I_{ポンプ}^{2}I_{ストークス}}$

イメージング実験においてより重要な特性である信号対雑音比（SNR）は、生成されるCARS光子の数の平方根に依存し、以下のように表される：^[16]

${\displaystyle SNR_{CARS}\propto N\chi _{ラマン}^{(3)}I_{ポンプ}{\sqrt {I_{ストークス}}}}$

反ストークス波長で光子を生成する他の非線形光学プロセスもあります。これらの信号は通常、CARS顕微鏡では非共鳴（NR）四波混合（FWM）背景と呼ばれます。これらの背景は、CARS信号に建設的または破壊的に干渉する可能性があります。^[17]ただし、共鳴画像と共鳴外画像を減算するか^{[18] [19]}、数学的手法を使用して背景のない画像を取得することで、この問題を部分的に回避できます。^[20]

SRS では、ポンプ波長からストークスレーザー波長へのエネルギー伝達の強度が信号として測定されます。SRS 信号を測定する方法は 2 つあります。1 つはストークスレーザーのパワーの増加を測定する方法で、これは誘導ラマンゲイン (SRG) と呼ばれます。もう 1 つはポンプレーザーのパワーの減少を測定する方法で、これは誘導ラマン損失 (SRL) と呼ばれます。パワーの変化は、ポンプレーザーとストークスレーザーの元のパワーと比較して 10 ⁻³～ 10 ⁻⁶のオーダーであるため、SRS 信号を抽出するために通常、変調転送方式^[21]が使用されます。^[22] SRS 信号は、次のようにポンプレーザーとストークスレーザーのパワーに依存します。

${\displaystyle I_{SRS}\propto N\chi _{ラマン}^{(3)}I_{ポンプ}I_{ストークス}}$

ショットノイズ制限検出は、検出器からの電子ノイズが光ノイズよりも十分に低く抑えられ、レーザーが検出周波数（変調周波数）でショットノイズ制限されている場合に達成できる。ショットノイズ制限の場合、SRS ^[16]の信号対雑音比（SNR）は

${\displaystyle SNR_{SRL}\propto N\chi _{ラマン}^{(3)}{\sqrt {I_{ポンプ}}}I_{ストークス}}$

${\displaystyle SNR_{SRG}\propto N\chi _{ラマン}^{(3)}I_{ポンプ}{\sqrt {I_{ストークス}}}}$

SRS の信号は、CARS 顕微鏡を悩ませる非共鳴バックグラウンドの影響を受けませんが、他の光学プロセス (例:相互位相変調、多色多光子吸収)によるはるかに小さな非共鳴バックグラウンドが存在する可能性があります。

SRS は、順方向とエピ方向のどちらでも検出できます。順方向検出 SRS では、変調されたレーザーは高 OD ノッチ フィルターによってブロックされ、もう一方のレーザーはフォトダイオードによって測定されます。変調されたレーザーから元々変調されていなかったレーザーに転送された変調は、通常、フォトダイオードの出力からロックイン アンプによって抽出されます。エピ検出 SRS では、通常、SRS 信号を検出する方法が 2 つあります。1 つは、中心に穴があるフォトダイオードによって対物レンズの前で後方散乱光を検出する方法です。もう 1 つの方法は、エピ検出 CARS 顕微鏡法に似ており、後方散乱光は対物レンズを通過し、通常は偏光ビーム スプリッターと 1/4 波長板の組み合わせを使用して光路の横に偏向されます。次に、ポンプ (またはストークス) レーザーをフィルターで除去した後、ストークス (またはポンプ) レーザーが検出されます。

1 組のレーザー波長では、単一の振動周波数にしかアクセスできません。異なる波数でサンプルを画像化すると、サンプルのより具体的で定量的な化学マッピングを提供できます。^{[23] [24] [25] [26] [27] [28]}これは、異なる波数で次々に画像化することで実現できます。この操作には常に何らかの調整が伴います。レーザーの 1 つの波長の調整、スペクトル フィルタリング デバイスの調整、またはスペクトル集束 CRS の場合はポンプ レーザーとストークス レーザー間の時間遅延の調整です。マルチカラー CRS を実行する別の方法は、狭いスペクトル帯域幅 (<1 nm) を持つ 1 つのピコ秒レーザーをポンプまたはストークスとして使用し、広いスペクトル帯域幅を持つもう 1 つのレーザーを使用することです。この場合、透過された広帯域レーザーのスペクトルは、格子によって広げられ、検出器のアレイによって測定されます。

CRS では通常、帯域幅が 1 nm 未満の狭帯域幅レーザーを使用して、約 15 cm ⁻¹の良好なスペクトル分解能を維持します。帯域幅が 1 nm 未満のレーザーはピコ秒レーザーです。スペクトル集束 CRS では、フェムト秒ポンプ レーザーとストークス レーザーがピコ秒レーザーに等しく線形チャープされます。^{[29] [30] [31]}有効帯域幅が小さくなるため、通常は広い帯域幅を持つフェムト秒レーザーでこの方法で高いスペクトル分解能を実現できます。スペクトル集束 CRS の波数調整は、レーザーの中心波長を変更するか、ポンプ レーザーとストークス レーザー間の遅延を変更することによって実現できます。

CRSの主な用途の1つはラベルフリー組織学であり、これはコヒーレントラマン組織学、または刺激ラマン組織学とも呼ばれます。^{[32] [33] [34] [35]} CRHでは、脂質およびタンパク質画像でCRS画像が得られ、いくつかの画像処理の後、H＆E染色に似た画像が得られます。H＆E染色とは異なり、CRHは生きた新鮮な組織で行うことができ、固定や染色は必要ありません。

^{グルコース[36]} 、コレステロール^[37]、薬物^[38]などの小分子の代謝は、生細胞におけるCRSを用いて研究されています。CRSは、比較的高いスループットで分子の分布と量を測定する方法を提供します。

ミエリンは脂質が豊富である。CRSは神経変性疾患やその他の神経疾患を研究するために、生体組織または固定組織のミエリンを画像化するために日常的に使用されている。^{[39] [40] [41]}

薬物の機能もCRSで研究することができます。例えば、抗白血病薬イマチニブは白血病細胞株でSRSを用いて研究されています。^[38]この研究は、細胞内でのイマチニブの代謝の可能性のあるメカニズムを明らかにし、薬物の有効性を向上させる方法についての洞察を提供しました。

CRSはラベルフリーイメージングを可能にするが、ラマンタグは特定のターゲットの信号を増幅するためにも使用できる。^{[42] [9] [8]}例えば、重水素化分子は、ラマン信号を他の分子からの干渉がない帯域にシフトするために使用される。同位体を含む特別に設計された分子は、SRSによる超多重化マルチカラーイメージングを実現するためにラマンタグとして使用することができる。^[10]

共焦点ラマン顕微鏡法では通常、連続波レーザーを使用して、画像内の各ポイントの広い波数範囲にわたる自発的なラマンスペクトルを提供します。各ピクセルのデータ取得に数秒かかるため、サンプル全体をスキャンするには長い時間がかかります。イメージングプロセス全体が長いため、移動しないサンプルに適しています。一方、CRSは単一の波数で信号を測定しますが、高速スキャンが可能です。より多くのスペクトル情報が必要な場合は、マルチカラーまたはハイパースペクトルCRSを使用できますが、スキャン速度またはデータ品質はそれに応じて低下します。^[43]

CRS 顕微鏡では、SRS と CARS を同じプロセスの 2 つの側面と見なすことができます。CARS 信号は常に非共鳴 4 波混合バックグラウンドと混合され、画像化される化学物質の濃度に 2 次依存します。SRS はバックグラウンドがはるかに小さく、画像化される化学物質の濃度に線形依存します。したがって、SRS は CARS よりも定量的イメージングに適しています。機器側では、SRS には変調と復調が必要です (例: ロックイン アンプまたは共鳴検出器)。マルチ チャネル イメージングの場合、SRS にはマルチ チャネル復調が必要ですが、CARS には PMT アレイまたは CCD のみが必要です。したがって、必要な機器は CARS よりも SRS の方が複雑です。^[16]

感度の面では、SRSとCARSは通常同様の感度を提供します。^[44]それらの違いは主に検出方法によるものです。CARS顕微鏡では、CARSプロセスで生成された光子を検出するために、PMT、APD、またはCCDが検出器として使用されます。PMTは、検出領域が広く、高速であるため、最も一般的に使用されます。SRS顕微鏡では、レーザービームの強度を測定するために通常フォトダイオードが使用されます。このような違いにより、CARSとSRSの用途も異なります。^[16]

PMTは通常、フォトダイオードに比べて量子効率が比較的低い。これはCARS顕微鏡のSNRに悪影響を及ぼします。また、PMTは650 nmより長い波長のレーザーに対する感度も低下します。そのため、CRSに一般的に使用されるレーザーシステム（Tiサファイアレーザー）では、CARSは主に高波数領域（2800〜3400 cm ⁻¹ ）でのイメージングに使用されます。CARS顕微鏡のSNRは通常、指紋イメージング（400〜1800 cm ⁻¹ ）には適していません。^[16]

SRS顕微鏡では、主にシリコンフォトダイオードを検出器として使用します。SiフォトダイオードはPMTよりもはるかに高い量子効率を持ち、これがSRSのSNRが多くの場合CARSよりも優れている理由の1つです。Siフォトダイオードは、レーザーの波長が850 nmより長い場合、感度が低下します。しかし、感度はまだ比較的高く、指紋領域（400〜1800 cm ⁻¹）での画像化が可能です。^[16]