RNA 完全性番号

RNA整合性番号(RIN) は、 RNA測定に整合性値を割り当てるアルゴリズムです。

RNA の完全性は遺伝子発現研究における大きな懸念事項であり、従来は28S rRNAと18S rRNA の比率を使用して評価されてきましたが、この方法は一貫性がないことがわかっています。^[1]この一貫性がないのは、28S ゲル画像と 18Sゲル画像を比較するには主観的な人間の解釈が必要であるためです。RIN アルゴリズムは、この問題を克服するために考案されました。RIN アルゴリズムは、通常キャピラリーゲル電気泳動を使用して得られる電気泳動 RNA 測定に適用され、RNA の完全性に関する情報を提供するさまざまな特徴の組み合わせに基づいて、より普遍的な測定を提供します。RIN は、他の RNA 完全性計算アルゴリズムと比較した研究で堅牢で再現性があることが実証されており、分析する RNA の品質を決定するための好ましい方法としての地位を固めています。^[2]

RIN に対する主な批判は、植物に使用する場合や、真核細胞と原核細胞の相互作用の研究での使用です。RIN アルゴリズムは、真核細胞/原核細胞/葉緑体のリボソーム RNA を区別することができないため、このような状況では品質指標が著しく過小評価されます。

電気泳動は、核酸に電場をかけて長さに基づいて核酸種を分離するプロセスです。核酸は負に帯電しているため、電場によってマトリックス（通常はアガロースゲル）に押し出され、小さな分子はより遠く、より速く押し出されます。^[3] キャピラリー電気泳動は、少量の核酸サンプルを非常に細いチューブ内のゲルに流すことができる技術です。機械には、核酸サンプルがチューブ内の特定のポイントを通過するタイミングを検知できる検出器があり、小さなサンプルが最初に通過します。これにより、図1のような電気泳動図が生成されます。ここで、長さはサンプルが検出器を通過する時間に関連しています。

マーカーは、サンプルと一緒に実行される既知のサイズのサンプルであり、このマーカーを基準として実行距離/時間を比較することで、サンプルの残りの部分の実際のサイズを知ることができます。

RNA は糖と窒素塩基からなる生体高分子で、すべての生体細胞で重要な役割を果たしています。RNA にはいくつかのサブタイプがあり、細胞内で最もよく見られるのはtRNA (トランスファー RNA)、rRNA (リボソーム RNA)、mRNA (メッセンジャー RNA) です。これら 3 つはすべて翻訳プロセスに関与しており、細胞 RNA の最も顕著な種 (約 85%) は rRNA です。そのため、RNA を電気泳動で分析すると、rRNA が最も目に見える種となり、RNA の品質を判断するために使用されます (以下の計算を参照)。rRNA にはさまざまなサイズがあり、哺乳類の rRNA は 5S、18S、28S のサイズに属します。28S rRNA と 5S rRNA はリボソームの大きなサブユニットを形成し、18S はタンパク質合成を担う分子機構であるリボソームの小さなサブユニットを形成します。 ^[4]

RNaseはどこにでも存在し、実験室でRNAサンプルを汚染し、その後分解することが多いため、RNAの完全性は非常に簡単に損なわれる可能性があり、その影響を排除するために設計された多くの実験技術につながっています。^{[5] [6]}しかし、これらの方法は絶対確実ではなく、サンプルが劣化する可能性があるため、分子アッセイの信頼性と再現性を確保するためにRNAの完全性を測定する方法が必要になります。RNAの完全性は、マイクロアレイ分析、ノーザンブロット、定量的リアルタイムPCR（qPCR）などの遺伝子発現研究で適切な結果を得るために重要です。^{[7] [8]}分解されたRNAは、計算された発現レベルに直接影響を及ぼし、多くの場合、見かけの発現が大幅に減少します。^[9]

qPCRや類似の技術は非常に高価で、時間と費用の両方をかなり要するため、遺伝子発現やその他の用途におけるqPCRの精度と再現性を維持しながらコストを削減するための研究が継続的に行われています。^[10] RIN評価により、科学者は遺伝子発現研究の実施に多大なコストがかかる前に、実験の信頼性と再現性を評価することができます。

RINはRNAの完全性を測定する標準的な方法であり、新しいRNA分離技術によって生成されたRNAの品質を評価するために使用できます。^[11]

RNAの完全性は分子生物学の研究において長い間問題となっていることが知られており、歴史的にRNAの完全性を決定するためにいくつかの方法が使用されてきた。最も人気があったのは長い間、エチジウムブロマイド染色によるアガロースゲル電気泳動であり、rRNAピークからのバンドを視覚化することができる。28Sバンドと18Sバンドの高さを互いに比較することができ、2：1の比率は分解されていないRNAを示す。^[1]この方法は非常に安価で簡単であるが、この方法にはいくつかの問題があり、主にその主観性により、一貫性がなく標準化されていないRNA品質評価につながること、そしてアガロースゲル上で可視化するために必要なRNAの量が多すぎるため、作業するRNAがあまり多くない場合は問題になる可能性がある。^{[1] [12]}また、アガロースゲル電気泳動では、ローディング不良、泳動ムラ、染色ムラなど、さまざまな問題が発生する可能性があり、アガロースゲル電気泳動を使用してRNAの完全性を決定する際の精度のばらつきが増大します。^[13]

RNA Integrity Number は、2005 年に Agilent Technologies によって開発されました。^[1]このアルゴリズムは、数百のサンプルを採取し、専門家がサンプルの完全性に基づいて 1 から 10 までの値を手動で割り当てることで生成されました。10 が最高値です。ベイズ学習手法を使用した適応学習ツールは、主に「計算」の項目に記載されている機能を使用して、RIN を予測できるアルゴリズムを生成するために使用されました。^{[1] [14]}これにより、すべての Agilent ソフトウェアが特定の RNA サンプルに対して同じ RIN を生成できるようになり、測定が標準化され、以前の方法よりも主観性が大幅に低減されます^[要出典]。

サンプルの RIN は、RNA 電気泳動図トレースのいくつかの特性を使用して計算されます。以下にリストされている最初の 2 つが最も重要です。RIN は電気泳動図に 1 ～ 10 の値を割り当てます。10 は最も分解が少ないことを示します。他の種の RNA は rRNA サイズが異なるため、以下の説明はすべて哺乳類の RNA に適用されます。^[1] 総 RNA 比は、18S および 28S rRNA ピークの下の面積とグラフ下の総面積の比を取ることによって計算されます。ここでは大きな数値が望ましく、これは rRNA の大部分がまだこれらのサイズであり、したがって分解はほとんどまたはまったく起こっていないことを示しています。理想的な比は図 1 に示されており、ほぼすべての RNA が 18S および 28S RNA ピークにあります。

28S ピークの高さには、大きな値が求められます。最も顕著な rRNA 種である 28S は、通常 18S rRNA よりも早く分解されるため、RIN 計算に使用され、そのピークの高さを測定することで、分解の初期段階を検出できます。これも図 1 に示されており、28S ピークが最も大きいため、これは適切です。

高速領域とは、電気泳動図上の 18S rRNA ピークと 5S rRNA ピークの間の領域です。最初は高速領域比の値が増加し、18S rRNA と 28S rRNA が中間サイズに分解されていることを示しますが、その後 RNA がさらに分解されてさらに小さいサイズになると、この比は減少します。したがって、値が低いからといって必ずしも RNA の完全性が良好または不良であることを示すわけではありません。

マーカーの高さが小さいことが望ましく、これは RNA の少量のみが分解され、短いマーカーで示される最小の長さにまで進んだことを示しています。ここで大きな数値が見つかった場合、大量の rRNA が小さな断片に分解され、このマーカーの近くで見つかることを示しています。この状況は、図 2 の「低品質」RNA 電気泳動図で確認できます。マーカー (左端) 上のピークの高さが非常に大きいため、RNA は大幅に分解されています。原核生物サンプルではアルゴリズムが多少異なりますが、Agilent 2100 Bioanalyzer Expert ソフトウェアでは、原核生物サンプルの RIN も計算できるようになりました。^[15]この違いは、哺乳類のサンプルでは28Sと18SリボソームRNAが主な種であるのに対し、原核生物のRNAではサイズがわずかに小さく、23Sと16Sにシフトしているため、それに合わせてアルゴリズムを変更しなければならないという事実から生じていると考えられます。原核生物のRNAの完全性数値を計算する際のもう1つの重要な事実は、RINが真核生物のRNAほど検証されていないことです。^[15]真核生物ではRIN値が高いほど下流の結果が良好になることが示されていますが、原核生物ではそれほど広範囲に行われていないため、原核生物ではそれほど意味がない可能性があります。

RINを計算するためのこれらの電気泳動図は、電気泳動を実行して電気泳動図を生成することができるAgilent Bioanalyzerマシンを使用して行われます。^[14] Agilent 2100ソフトウェアは、正確なアルゴリズムが独自のものであるため、RINソフトウェアを独自に実行することができ、計算に使用される追加の重要なRNA電気泳動図機能がありますが、これらは公開されていません。

• Agilent Technologies からの RIN 情報
• BMC Molecular Biology の RIN 記事
• RIN が必要な理由を示す Nature の遺伝子発現の概要
• Agilent Technologies による RIN の説明と、さまざまな RIN 値での電気泳動図の例をいくつか示します。
• ユタ大学のゲル電気泳動シミュレーションは、電気泳動図がどのように生成されるかを視覚化するのに役立つ。