タンパク質化学シフトの再参照

タンパク質化学シフトの再参照は、割り当てられた NMR 化学シフトを、タンパク質化学シフト参照におけるIUPACおよび BMRB 推奨標準と一致するように調整する、割り当て後のプロセスです。NMR では、化学シフトは通常、NMR サンプルに溶解した内部標準を参照します。これらの内部標準には、テトラメチルシラン(TMS)、4,4-ジメチル-4-シラペンタン-1-スルホン酸(DSS)、およびトリメチルシリルプロピオネート(TSP) が含まれます。タンパク質NMR 分光法の場合、推奨される標準はDSSであり、これは pH の変化の影響を受けません (TSP とは異なります)。さらに、DSS 1H信号は、簡単な比率計算を使用して13Cおよび 15N シフトを間接的に参照するために使用できます[1]。残念ながら、多くの生体分子NMR 分光法ラボでは、 1H、13C、または 15N「ゼロ点」化学シフト位置を決定するために非標準的な方法を使用しています。この標準化の欠如により、異なる研究室間で同じタンパク質の化学シフトを比較することが困難になります。また、化学シフトを使用して二次構造を適切に識別または割り当てたり、化学シフトの改良によって 3D 構造を改善したりすることも困難になります。化学シフトの再参照は、これらの参照エラーを修正し、研究室間でタンパク質の化学シフトの報告を標準化する手段を提供します。

不正確な化学シフト参照は、生体分子 NMR において特に深刻な問題です。^[1] 13C シフト割り当ての最大 20% 、15N シフト割り当ての最大 35% が不適切に参照されていると推定されています。^{[2] [3] [4]}化学シフトに含まれる構造情報と動的情報は非常に微妙な場合が多いため、これらの微妙な違いを検出できるように、タンパク質の化学シフトを適切に参照することが重要です。基本的に、化学シフト参照の問題は、化学シフトが絶対周波数測定ではなく相対周波数測定であるという事実に起因しています。化学シフト参照に関する歴史的な問題のため、化学シフトはおそらくNMR 分光法全体で最も正確に測定できるものの、最も正確に測定されていないパラメーターです。^{[5] [3]}

生体分子NMRにおける化学シフト参照の問題の大きさと深刻さのため、この問題を軽減するために多くのコンピュータプログラムが開発されてきました（概要については表1を参照）。生体分子NMRにおける化学シフトの誤参照に包括的に取り組んだ最初のプログラムはSHIFTCORでした。^[2]

表1. さまざまな化学シフト再参照および誤割り当て検出プログラムの概要と比較。^[5]

SHIFTCOR は、統計的手法を使用して、実験的に測定された化学シフトの入力セットに対して、予測される NMR 化学シフト (タンパク質の 3D 構造から得られる) を比較して修正する、自動化されたタンパク質化学シフト修正プログラムです。SHIFTCOR は、いくつかの単純な統計的アプローチと事前に決定されたカットオフ値を使用して、潜在的な参照、割り当て、およびタイプミスを特定して修正します。SHIFTCOR は、観測されたバックボーン(1Hα、13Cα、13Cβ、13CO、15N、および 1HN) シフトの各セットの平均値と、それに対応する予測化学シフトの差を比較することにより、潜在的な化学シフト参照の問題を特定します。これら 2 つの平均値の差により、核固有の化学シフトオフセットまたは参照修正 ( 1H用、 13C用、および 15N 用に 1 つずつ) が生成されます。特定の極端な外れ値がこれらの平均オフセット値に不当な偏りをもたらさないようにするために、観測されたシフトの平均は、潜在的な誤割り当てやタイプミスを除外した後にのみ計算されます。^[2]

SHIFTCORは、各核の化学シフトオフセットまたは差異を生成して報告します。結果には、化学シフト分析（潜在的な誤割り当てのリスト、推定参照エラー、計算された参照オフセットの推定エラー（95％信頼区間）、適用または推奨された参照オフセット、相関係数、RMSD値を含む）と、修正されたBMRB形式の化学シフトファイルが含まれます（詳細については図1を参照）。^[2]

SHIFTCORは、化学シフト計算プログラムSHIFTX ^[12]を使用して、分析対象のタンパク質の3D構造座標に基づいて1Hα、13Cα、15Nシフトを予測します。予測されたシフトと観測されたシフトを比較することで、SHIFTCORは化学シフト参照オフセットと潜在的な誤割り当てを正確に特定できます。SHIFTCORアプローチの主な制限は、化学シフト参照オフセットを評価するために、ターゲットタンパク質の3D構造が必要であることです。化学シフトの割り当ては通常、構造が決定される前に行われるため、構造に依存しないアプローチの開発が必要であることがすぐに認識されました。^[5]

分析対象のタンパク質の推定（1Hまたは13Cシフト経由）または予測（配列経由）二次構造内容を利用するいくつかの方法が開発されています。これらのプログラムには、PSSI、 ^[10] CheckShift、^{[6] [7]} LACS、^{[4] [9]およびPANAV [11]}が含まれます。PANAV <[1]> と CheckShift はどちらもウェブサーバーとしても利用できます。

PSSI および PANAV プログラムは、1H シフトによって決定される二次構造(ほとんど誤参照されない) を使用して、ターゲット タンパク質の13Cおよび 15N シフトを 1H 由来の二次構造と一致するように調整します。LACS は、二次 13Cα シフトまたは二次 13Cβ シフトに対してプロットされた二次 13Cα シフトと 13Cβ シフトの差を使用して、参照オフセットを決定します。LACS の最新バージョンは、15N 化学シフトの誤参照を識別するように調整されています。^[4]この新しいバージョンの LACS は、二次 15N シフトと、先行する残基の二次 13Cα シフトおよび 13Cβ シフトとの間のよく知られた関係を利用しています。^{[3] LACSやPANAV/PSSIとは対照的に、CheckShiftはPSIPRED [13]}などの高性能二次構造予測プログラムから予測された二次構造を使用して、13Cおよび15N化学シフトを繰り返し調整し、それらの二次シフトが予測された二次構造と一致するようにします。これらのプログラムはすべて、BMRBに保存されている誤って参照されたタンパク質化学シフトを正確に識別し、適切に再参照することが示されています。 ^{[7] [11]} LACSとCheckShiftはどちらも13Cαシフトと13Cβシフトに対して常に同じオフセットを予測するようにプログラムされていますが、PSSIとPANAVはこのような仮定を行っていないことに注意してください。一般的なルールとして、PANAVとPSSIは通常、計算された参照オフセットの広がり（または標準偏差）が小さく、これらのプログラムがLACSまたはCheckShiftよりもわずかに正確であることを示しています。 LACSもCheckShiftも、非常に大きな（40ppmを超える）参照オフセットを持つタンパク質を扱うことができませんが、PANAVとPSSIは、このような異常なタンパク質を扱うことができるようです。^[11]

最近の研究^{[11]では、}化学シフト再参照プログラム（PANAV）を、割り当てられた化学シフトの十分な割合（> 80%）を持つ合計2421のBMRBエントリに対して実行し、堅牢な化学シフト参照補正を実行しました。合計243のエントリで13Cαシフトが1.0 ppm以上オフセットされ、238のエントリで13Cβシフトが1.0 ppm以上オフセットされ、200のエントリで13C'シフトが1.0 ppm以上オフセットされ、137のエントリで15Nシフトが1.5 ppm以上オフセットされました。この研究から、BMRBのエントリの19.7%が誤って参照されているようです。明らかに、化学シフト参照は、生体分子NMRコミュニティにとって依然として重要であり、まだ解決されていない問題です。^{[5] [11]}

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• Wishart, DS; Sykes BD; Richards FM (1992). 「化学シフト指数 - NMR分光法によるタンパク質二次構造の割り当てのための迅速かつ簡単な方法」.生化学. 31 (6): 1647–1651. CiteSeerX  10.1.1.539.2952 . doi :10.1021/bi00121a010. PMID  1737021.
• Wishart, DS; Sykes B ( 1994)。「C-13 化学シフト インデックス - C-13 化学シフト データを使用したタンパク質の二次構造の識別のための簡単な方法」。Journal of  Biomolecular NMR。4 ( 2): 171–180。doi :10.1007/BF00175245。PMID 8019132。S2CID 42323147  。
• Osapay, K; Case DA (1994). 「タンパク質の規則的な二次構造におけるプロトン化学シフトの解析」。Journal of Biomolecular NMR . 4 (2): 215–230. doi :10.1007/bf00175249. PMID  8019135. S2CID  33487411.
• Gronenborn, AM; Clore GM (1994). 「13C 化学シフトによる N 末端ヘリックスキャッピングボックスの識別」。Journal of Biomolecular NMR . 4 (3): 455–458. doi :10.1007/bf00179351. PMID  8019146. S2CID  8355611.
• Moseley, HN; Sahota G; Montelione GT (2004). 「タンパク質共鳴割り当てデータの評価と表示のための割り当て検証ソフトウェア スイート」。Journal of Biomolecular NMR . 28 (4): 341–355. doi :10.1023/B:JNMR.0000015420.44364.06. PMID  14872126. S2CID  14483199.