P要素

P要素は、ショウジョウバエで雑種形成不全と呼ばれる遺伝形質の原因因子として発見された転移要素です。トランスポゾンはP要素のP形質の原因であり、野生のハエにのみ見られます。また、他の多くの真核生物にも見られます。 ^[1]

この名前は、進化生物学者のマーガレット・キッドウェルによって最初に提案されました。彼女はジェームズ・キッドウェルとジョン・スヴェドとともに、ショウジョウバエの雑種発育不全を研究していました。彼らは、この生殖役割において雑種発育不全に寄与する系統を、父性（P）と母性（M）の頭文字をとって「P」と呼びました。^[2]

Pエ​​レメントはP トランスポザーゼと呼ばれる酵素をコード化します。実験室で飼育された雌とは異なり、野生型の雌は、まさに同じエレメントによって生成されるPトランスポザーゼ機能の阻害剤も発現すると考えられています。この阻害剤は、 Pエレメントの移動によって引き起こされるゲノムの破壊を軽減し、生殖可能な子孫を可能にします。この証拠は、実験室の雌 ( Pトランスポザーゼ阻害剤を欠く) と野生型の雄 ( Pエレメントを持つ) の交配から得られます。阻害剤がない場合、Pエレメントはゲノム全体で増殖し、多くの遺伝子を破壊し、子孫に致命的または不妊になることがしばしばあります。

Pエ​​レメントは、ショウジョウバエを用いた遺伝子実験で突然変異誘発剤としてよく使用されます。このアプローチの利点の 1 つは、突然変異の位置を特定しやすいことです。雑種発育不全では、ショウジョウバエの 1 つの系統が別のショウジョウバエの系統と交配して雑種の子孫が生まれ、発育不全として知られる染色体の損傷を引き起こします。雑種発育不全には両親からの寄与が必要です。たとえば、P系統が父方の寄与でM系統が母方の寄与であるPMシステムでは、発育不全が発生する可能性があります。M細胞型の父親とPの母親との逆交配では、 P x PまたはM x M方式で交配されるため、正常な子孫が生まれます。P雄染色体は、 M雌 と交配すると発育不全を引き起こす可能性があります。

Pエ​​レメントはクラス IIトランスポゾンであり、DNA ベースの「カット アンド ペースト」メカニズムによって移動する。認識配列は、 3 つのイントロンで区切られた4 つのエクソンで構成される。^[3]イントロンの完全なスプライシングによりトランスポザーゼ酵素が生成され、イントロン 1 と 2 の選択的部分スプライシングにより、mRNA 転写産物にイントロン 3 のみが残り、 Pエレメントリプレッサーがコードされる。完全な自律的Pエレメントはトランスポザーゼ酵素をコードし、この酵素はPエレメントの両端にある31 bp の末端逆位反復を認識し、 Pエレメントの切除と再挿入を触媒する。完全なエレメントの長さは 2,907 bp である。非自律的Pエレメントには、トランスポザーゼ生成を阻害するさまざまな長さの内部欠失が含まれるが、機能的なトランスポザーゼがゲノムの他の場所にコードされている場合は、このようなエレメントも動員される可能性がある。Pエ​​レメントの挿入とそれに続く切除により、切除部位に 8 bp の直接反復が必ず残ります。したがって、このような反復の存在は、以前のPエレメントの活動を示しています。

すべてのPエレメントは、31 bp の末端逆位反復と、トランスポザーゼの THAP ドメインに位置する 11 bp の内部逆位反復を含む標準構造を持っています。最短および最長のPエレメントは非自律エレメントです。最長のPエレメントは、転位に必要なトランスポザーゼをコードします。トランスポザーゼをコードしている同じ配列は、転位の抑制因子もコードしており、これは細胞の発生中に細胞質に蓄積します。したがって、 PまたはM の雄とPの雌の交配では、雌の細胞質に抑制因子が含まれ、これがすべてのPエレメント に結合して転位を防止します。

雑種発育不全とは、自律的なP要素を持つ雄 ( P系統/ P細胞型) とP要素を欠く雌 ( M系統/ M細胞型)の交配によって生じるショウジョウバエ系統の生殖細胞における突然変異率の高さを指します。雑種発育不全症候群は、温度依存性不妊、突然変異率の上昇、染色体の再編成と組み換えの増加を特徴とします。

雑種異形成表現型は、P系統の雄とM系統の雌の子孫の生殖細胞内のP要素の転位によって影響を受けます。転位は生殖細胞でのみ発生します。これは、トランスポザーゼmRNA を作成するために必要なスプライシングイベントが体細胞では発生しないためです。

雑種異形成は、P系統の雄とM系統の雌を交配すると発現し、 P系統の雌 (自律的なP要素を持つ雌) とM系統の雄を交配すると発現しない。P 系統の雌の卵子には、トランスポザーゼ遺伝子の転写を妨げるリプレッサータンパク質が大量に含まれている。リプレッサータンパク質を含まないM系統の母親の卵子では、父親の精子からのP要素の転座が可能になる。P系統の雌では、リプレッサーは細胞質に存在する。したがって、P 系統の雄が M 系統の雌 (細胞質にリプレッサーを含まない) を受精すると、雄はP要素を含むゲノムを提供するが、雄の細胞質は提供しないため、P系統の子孫が生まれる。^[3]

この効果はpiRNAが母系でのみ継承されることに寄与し、P要素に対する防御機構を提供する。^[4]

Pエ​​レメントは、ショウジョウバエ研究において変異原として広く使用されています。変異誘発システムでは、通常、自律的だが移動しないエレメントと、移動可能な非自律的エレメントが使用されます。その後、後続の世代のハエは、表現型またはPCRによってスクリーニングできます。天然のPエレメントには、トランスポザーゼ酵素のコード配列と、トランスポザーゼの作用の認識配列が含まれています。トランスポザーゼは、宿主 DNA からのPエレメントの切除を制御および触媒し、2 つの認識部位で切断してからランダムに再挿入します。ランダムな挿入は、既存の遺伝子に干渉したり、追加の遺伝子を運んだりする可能性があり、遺伝子研究に使用できます。

これを有用かつ制御可能な遺伝ツールとして使用するには、制御不能な転位を防ぐためにP要素の 2 つの部分を分離する必要があります。通常の遺伝ツールは、転位酵素認識配列がないため挿入できない転位酵素をコードする DNA と「 Pプラスミド」です。P プラスミドには、常にショウジョウバエのレポーター遺伝子、多くの場合赤目マーカー (白遺伝子の産物)、および転位酵素認識配列が含まれます。P プラスミドには、関心のある遺伝子、大腸菌の選択マーカー遺伝子、多くの場合何らかの抗生物質耐性、複製起点、またはその他の関連するプラスミド「ハウスキーピング」配列が含まれる場合があります。

これらのツールを利用するには、主に 2 つの方法があります。

1. P要素をプラスミドにクローン化し、これを細菌内で形質転換して増殖させます。
2. Pトランスポザーゼを除去し、目的の遺伝子に置き換えます。
3. 初期段階（細胞化前）の胚の後端に、トランスポザーゼをコードする DNA と、レポーター遺伝子、目的の遺伝子、およびトランスポザーゼ認識配列を含むプラスミドをマイクロインジェクションします。
4. ランダムな転座が起こり、目的の遺伝子とレポーター遺伝子が挿入されます。
5. 目的の遺伝子が挿入されると、独自のPトランスポザーゼを生成できなくなるため、移動できなくなります。
6. ハエを育てて交配し、生物の細胞間の遺伝的変異を除去します。(生物の細胞の一部のみが形質転換されます。うまくいけば、これらの形質転換された細胞の一部が生殖細胞系列に残ります。形質転換された配偶子からは、細胞間の変異のない生物が生まれます。)
7. レポーター遺伝子を発現しているハエを探します。これらは挿入された目的の遺伝子を持っているので、調査して目的の遺伝子による表現型を決定することができます。

挿入された遺伝子が宿主の遺伝子の 1 つの機能を損傷している可能性があります。比較を行い、追加の遺伝子がノックアウトされていないことを確認するには、複数のハエの系統が必要です。

1. トランスポザーゼをコードする DNA と、レポーター遺伝子およびトランスポザーゼ認識配列 (多くの場合、大腸菌レポーター遺伝子および複製起点など)を含むプラスミドを胚にマイクロインジェクションします。
2. ランダムな転位が発生し、レポーター遺伝子がランダムに挿入されます。挿入は活発に転写されている遺伝子の近くで発生する傾向があります。これは、クロマチン構造が最も緩い場所であり、DNA に最もアクセスしやすいためです。
3. ハエを育てて交配し、生物の細胞間の遺伝的変異を除去します (上記参照)。
4. レポーター遺伝子を発現しているハエを探します。これらは転座に成功しているため、既存の遺伝子の変異による表現型を判定するために調査することができます。

可能性のある変異:

1. 翻訳領域への挿入 => ハイブリッド タンパク質/切断されたタンパク質。通常はタンパク質機能の喪失を引き起こしますが、より複雑な影響も見られます。
2. イントロンへの挿入 =>スプライシングパターンの変更/スプライシングの失敗。通常は、タンパク質の切断または不活性な誤ったスプライシング産物の生成を引き起こしますが、より複雑な影響がよく見られます。
3. 5' (mRNA 5' UTR になる配列) 非翻訳領域への挿入 => 転写産物の切り捨て。通常、mRNA に5' キャップが含まれなくなり、翻訳の効率が低下します。
4. プロモーターへの挿入 => 発現の減少/完全な消失。常にタンパク質生成レベルが大幅に減少します。状況が単純なため、分析に最も役立つ挿入タイプです。
5. プロモーターと上流エンハンサー間の挿入 => エンハンサー機能の喪失/レポーター遺伝子のエンハンサー機能の乗っ取り。† 一般的に細胞タイプに対するタンパク質特異性のレベルが低下しますが、複雑な影響が見られることもよくあります。

別の遺伝子からエンハンサーをハイジャックすると、そのエンハンサーの機能を分析できます。特にレポーター遺伝子が蛍光タンパク質用である場合、これは生物全体での変異遺伝子の発現をマッピングするのに役立ち、非常に強力なツールです。これは、遺伝子発現パターン (時間的および空間的) を調べるのに役立つツールです。

これらの方法は逆遺伝学と呼ばれています。逆遺伝学は、DNA配列決定によって得られた特定の遺伝子配列の表現型効果を分析することで遺伝子の機能を発見するアプローチです。

変異したタンパク質の機能が決定されたら、次の方法で挿入部分の両側の領域を配列決定/精製/クローン化することができます。

1. ハエのゲノムを分離します。
2. 軽い消化（レポーター遺伝子を切断しないことが知られている酵素 [酵素 1] を使用）を受け、数キロベースの断片（挿入とその隣接する DNA を含むいくつかの断片）が得られます。
3. 消化物を自己連結し (自己連結を確実にするために DNA 濃度を低くする)、挿入とその隣接する DNA を含むいくつかの環状 DNA 断片を選択します。
4. レポーター遺伝子のある時点でプラスミドを切断します（ゲノム DNA ではほとんど切断しないことが知られているが、レポーター遺伝子では切断することが知られている酵素 [酵素 2] を使用）。
5. レポーター遺伝子セクションのプライマーを使用して、DNA を増幅し、配列を決定することができます。

切断、自己連結、再切断のプロセスにより、配列を知らなくても DNA の隣接領域を増幅できます。連結が起こったポイントは、[酵素 1] の切断部位を特定することで確認できます。

1. ハエのゲノムを分離します。
2. 軽い消化（レポーター遺伝子と大腸菌レポーター遺伝子およびプラスミド配列の境界を切断することが知られている酵素 [酵素 1] を使用）を受け、数キロベースの断片（大腸菌レポーター、プラスミド配列、およびその隣接 DNA を含む）が得られます。
3. 消化物を自己連結し（自己連結を確実にするために DNA 濃度を低くする）、選択された環状 DNA 断片（大腸菌レポーターを含む断片、プラスミド配列、およびその隣接 DNA）を生成します。
4. プラスミドを大腸菌細胞に挿入します（例：エレクトロポレーション）。
5. 大腸菌 選択マーカー遺伝子のプラスミドを選択します。プラスミドの「ハウスキーピング」配列を持つプラスミドの挿入が成功した場合にのみ、この遺伝子が発現します。
6. 遺伝子はさらなる分析のためにクローン化することができます。

• Leland Hartwell 他 2004.遺伝学 - 遺伝子からゲノムへ第 2 版 McGraw-Hill
• エンゲルス、WR ショウジョウバエのP要素

• フライベース