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NAIL-MS （核酸同位体標識結合質量分析法の略）は、核酸とその修飾を調査するために使用される質量分析法に基づく技術です。これにより、生体内でのRNA生物学の根本的なメカニズムを研究するためのさまざまな実験設計が可能になります。たとえば、生細胞内の核酸の動的な挙動、特にRNA修飾をより詳細に追跡することができます。[ 1 ]
NAIL-MSはRNA修飾機構の研究に用いられます。そのため、培養細胞にまず安定同位体標識栄養素を与え、細胞はこれらを生体分子に取り込みます。核酸（多くの場合RNA）を精製した後、質量分析法によって分析を行います。質量分析法はイオンの質量電荷比を測定する分析手法です。質量分析計では、質量差によって、化学的に同一でありながら安定同位体組成が異なるヌクレオシドのペアを区別することができます。したがって、標識されていないヌクレオシドは、安定同位体標識された同位体異性体と区別できます。ほとんどのNAIL-MS法では、標識されたヌクレオシドが標識されていないヌクレオシドよりも2 Da以上重いことが重要です。これは、天然に存在する炭素原子の1.1%が13C同位体であるためです。ヌクレオシドの場合、これはヌクレオシドの約10%で1 Daの質量増加につながります。この信号は、測定結果の最終評価を妨げるだろう。
NAIL-MS は、実験中に対応する培養培地の標識栄養素を変更することにより、RNA 修飾ダイナミクスを調査するために使用できます。さらに、細胞集団を精製バイアスの影響を受けることなく直接比較できます。さらに、質量分析法による定量化に必要なほとんどのヌクレオシドの生合成同位体分子の生成や、まだ知られていない RNA 修飾の発見にも使用できます。[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]
一般的に、細胞は非標識または安定同位体（非放射性）標識培地で培養されます。例えば、培地には通常の炭素12（12C ）の代わりに6個の炭素13原子（13C ）で標識されたグルコースが含まれる場合があります。この培地で増殖する細胞は、モデル生物に応じて、重いグルコースをすべてのRNA分子に取り込みます。その後、リボースの完全な炭素標識により、すべてのヌクレオチドは非標識同位体よりも5 Da重くなります。細胞の培養と適切な標識の後、細胞は通常、フェノール/クロロホルム/グアニジンイソチオシアネートを用いて回収されます。他の抽出方法も可能であり、場合によっては必要になります（例えば酵母の場合）。RNAは、フェノール-クロロホルム抽出とイソプロパノール沈殿によって分離されます。特定のRNA種（例えばrRNA、tRNA）のさらなる精製は通常、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）によって行われますが、他の方法も利用可能です。ほとんどのアプリケーションでは、最終生成物をLC-MSで分析する前にヌクレオシドに酵素的に消化する必要があります。そのため、ベンゾナーゼ、NP1、CIPなどの消化酵素が使用されます。[ 5 ] [ 6 ]通常、測定にはMRMモードのトリプル四重極が使用されます。
RNA分子の標識方法は、モデル生物によって異なります。大腸菌（細菌）の場合、最小培地M9を使用し、必要な塩の安定同位体標識体を添加することができます。これにより、13C炭素、15N窒素、34S硫黄、2H水素による標識が可能になります。[ 7 ] S.cerevisiae（酵母）の場合、現在2つの方法があります。1つ目は、市販の完全増殖培地を使用することで、13C炭素および/または15N窒素による標識が可能になります。2つ目は、最小YNB培地を使用し、 RNAの13C炭素、15N窒素、2H水素標識を実現するために、安定同位体標識体として添加できるいくつかのアミノ酸とグルコースを添加する必要があります。[ 8 ]
大腸菌やサッカロミセス・セレビシエなどのモデル生物における標識は比較的簡単である一方、細胞培養における安定同位体標識は、培養培地の組成がはるかに複雑であるため、はるかに困難である。安定同位体標識グルコースの添加も、グルタミンやアスパラギン酸などのヌクレオシド生合成の単純な前駆体の安定同位体標識変異体の添加も、2 Daを超える明確な質量増加には十分ではない。代わりに、細胞培養で維持されているほとんどの細胞には、メチル基の標識のために安定同位体標識メチオニンを、ヌクレオシドの塩基体の標識のためにアデニンとウリジンの安定同位体標識変異体を与えることができる。 [ 9 ]ヌクレオシドの生合成に使用される小さな代謝物も含まれているため、培地にFBS（ウシ胎児血清）を添加する場合は特別な注意が必要である。したがって、すべてのヌクレオシドの明確な標識化が必要な場合は、透析済みFBSの使用が推奨される。
NAIL-MSを用いることで、様々な実験デザインが可能となる。
NAIL-MS は安定同位体標識内部標準 (ISTD) の製造に使用できます。そのため、細胞はすべてのヌクレオシドが完全に標識される培地で培養されます。精製されたヌクレオシドの混合物は、質量分析法によるヌクレオシドの正確な絶対定量に必要な ISTD として使用できます。この標識ヌクレオシドの混合物は、SILIS (安定同位体標識内部標準) とも呼ばれます。[ 10 ]このアプローチの利点は、生物に存在するすべての修飾を標識化合物として生合成できることです。SILIS の製造は、NAIL-MS という用語が登場する前から行われていました。
比較NAIL-MS実験は、タンパク質ではなくRNAを対象とするSILAC実験と非常によく似ています。まず、それぞれの細胞を2つの集団に分けて培養します。一方の細胞集団には標識されていない栄養素を含む培地を与え、もう一方の細胞集団には安定同位体標識された栄養素を含む培地を与えます。すると、細胞はそれぞれの同位体異性体をRNA分子に取り込みます。一方の細胞集団は対照群として機能し、もう一方の細胞集団は関連する研究（例えば、KO株、ストレス）の対象となります。2つの細胞集団を回収した後、それらを混合して一緒に処理することで、精製バイアスを排除します。ヌクレオシドに取り込まれた栄養素の質量が異なるため、質量分析法によって2つの細胞集団を区別することが可能です。
パルスチェイス実験を開始すると、培地は培地(1)から培地(2)に切り替えられます。2つの培地は同位体組成のみが異なる必要があります。これにより、実験開始前に既に存在していたRNA分子（培地(1)で培養されたRNA分子）と、実験開始後に新たに転写されたRNA分子（培地(2)で培養されたRNA分子）を区別することが可能になります。この方法により、生体内における修飾ダイナミクスを詳細に研究することができます。培地(1)または培地(2)のいずれかに標識メチオニンを添加することで、メチル化プロセスを追跡できます。その他の同位体標識代謝物を用いることで、さらなる修飾解析が可能になります。
NAIL-MSは、質量分析法によるRNA修飾ダイナミクスの調査を可能にする。この技術により、生きた細菌内のいくつかのRNA損傷に対する酵素的脱メチル化が観察されている。[ 4 ] [ 7 ]
未解明の修飾を発見するために、細胞は非標識培地、13C標識培地、15N標識培地、2H標識培地、または34S標識培地で培養される。質量分析中に発生する未知のシグナルは、異なる標識を施したすべての培養物で検査される。適切なm/z値を持つ未知化合物の保持時間が重なる場合、異なる標識を施した培養物における重なるシグナルの質量差を計算することで、化合物の総和式を推定することができる。この方法により、いくつかの新しいRNA修飾が発見された。この実験設計は、NAIL-MSの概念の出発点となった最初のアイデアでもあった。
NAIL-MSは質量分析法によるオリゴヌクレオチド分析にも適用できます。これは配列情報を保持する必要がある場合に便利です。[ 11 ]