マイクロトックスバイオアッセイ

Microtoxは、生物発光細菌 ( Allivibrio fischeri、旧称 Vibrio fischeri )を使用して、水、空気、土壌、堆積物などのさまざまな基質に含まれる毒性物質を検出するin vitro試験システムです。^[1] Allivibrio fischeriは非病原性の海洋細菌で、代謝の自然な一部として発光します。^[2]毒性物質にさらされると、細菌の呼吸プロセスが中断され、光の出力が低下します。^[2] Allivibrio fischeri は、さまざまな毒性物質に対して高い感度を示しています。毒性に対する反応は、細胞呼吸の副産物である発光の変化として観察されます。^{[2]この変化を使用して、毒性と直接相関する}Allivibrio fischeriの阻害率を計算できます。^[2]

マイクロトックスは、当時利用可能な毒性試験の費用対効果の高い代替手段として、1979年にアズール・エンバイロメンタル（旧マイクロビクス・コーポレーション）によって開発されました。 [ ^{3] [ 4]}マイクロトックス以前は、水に対する毒性試験の大半は魚類とミジンコ類に特化していました。^{[3] [4]}マイクロトックスは、その誕生以来、水だけでなく土壌や堆積物などの他の基質の毒性を試験するための標準的な方法となっています。^{[3] [5] [6]}

近年、マイクロトックスの技術と名前はさまざまな所有者に引き継がれてきました。2011年に、マイクロトックスと関連技術は、ストラテジック・ダイアグノスティクス・インコーポレイテッド（SDIX）から約450万ドルでモダン・ウォーターに買収されました。^[7] SDIX以前は、マイクロトックスは元の開発者であるアズール・エンバイロメンタルによって所有されていました。^[3]

Microtoxは、生物発光細菌（Allivibrio fischeri）を利用して、特定の物質や基質の毒性を判定します。^{[3] [5]細胞代謝中、これらの細菌は}細胞呼吸の一環として自然に光を発し、これを発光として測定できます。^[3]毒性物質にさらされると、発光の減少が観察され、発光の変化率は毒性と直接相関しています。^[4] Allivibrio fischeriが特に選択されたのは、これらの細菌は凍結乾燥によって保存できるため、保存期間と使用期間を延ばすことができるためです。^{[3]この技術を使用して、固相（土壌と堆積物）と水性}急性毒性試験（以下で説明）の両方を実施できます。^[6]

Microtoxモデル500は、急性毒性を測定する実験室ベースの光度計です。この分析装置は、温度制御された自己校正バイオセンサー測定システムであり、 Allivibrio fischeriの生物発光を利用して、汚染された水、または汚染された土壌や堆積物の溶出物の毒性を判定します。^[8]

マイクロトックス連続毒性モニター（CTM）は、水源の毒性を継続的に測定し、即座に結果を提供する、現場固有のマイクロトックス分析装置です。この全自動分析装置は、汚染源がわかっているかどうかに関係なく、数千の汚染物質を同時に特定できる広い検出範囲を備えています。この装置は、最大4週間連続して稼働することができ、操作とメンテナンスが簡単です。^[9]

DeltaTox IIは、急性毒性およびアデノシン三リン酸(ATP) の検査に使用できるポータブル機器です。Microtox モデル 500 のポータブル版としても知られるこの機器は、簡単な検査を提供し、サンプルサイズが小さく、水サンプルを分析するための費用対効果の高いアプローチです。この高感度で迅速な検査分析装置は、微生物汚染だけでなく、2,700 種類以上の化学物質を検出することができます。^[10]

急性試薬の保存期間は2年、溶液の保存期間は適切に保管した場合3年です。^[11]

マイクロトックス急性試薬は、アリービブリオ・フィシェリの凍結乾燥培養物であり、検査前に再構成される。試薬は再構成後3時間以内に使用することが推奨される。推奨された期間を過ぎると、試薬の感度が変化する可能性がある。^[11]

マイクロトックス浸透圧調整溶液（MOAS）は、22％塩化ナトリウム（NaCl ）と超純水で構成された無毒の溶液です。この溶液をサンプルに加えると、浸透圧が約2％NaClに調整されます。^[11]

再構成溶液は特別に調製された無毒の超純水で構成されています。^[11]

希釈液は超純水に2%の塩化ナトリウムを溶かした無毒の溶液です。この溶液はサンプルと試薬を希釈するために使用され、また、アリービブリオ・フィッシャーリに必要な浸透圧保護も提供します。^{[11] [12]}

Microtoxは、飲料水、雨水流出水、廃水、産業排水、土壌、堆積物など、さまざまなマトリックスに適用できます。 ^{[5]ほとんどのサンプルは、}塩分濃度を2％に調整する以外に、検査前に特別な準備は必要ありません。^[3]ただし、濁度が高いなどの特定の特性を持つサンプルでは、​​特別な準備が必要になる場合があります。^{[3]サンプルの}塩分濃度を調整して塩分濃度を下げる必要がある場合は、適切な量のMicrotox浸透圧調整溶液を加えてサンプルを希釈することで実現できます。たとえば、サンプル1mLにMOAS 0.1mLを加えると、元の濃度の90.9％に希釈されます。^[3]より高い塩分濃度が必要な場合は、固体塩化ナトリウムをサンプルに溶解して、 Allivibrio fischeriを保護するために最終塩分濃度を2％にすることができます。^[3]粒子状物質を含む非常に濁ったサンプルは、試験を行う前に沈殿させる必要があります。^[3]サンプル内の粒子状物質は、光を吸収して生物発光を妨げ、誤解を招く試験結果をもたらす可能性があります。発光の妨害は、色の濃いサンプル（特に赤、茶色、黒）でも発生する可能性があります。^[3]試験で許容できる透明度を得るために、サンプルを遠心分離する必要がある場合があります。[ 3 ^{]サンプルに}塩素が含まれている場合、 Allivibrio fischeriに対する毒性が変化し、誤解を招く結果をもたらす可能性があります。サンプルは、試験結果に影響を与えないチオ硫酸ナトリウムと脱イオン水の溶液を使用して脱塩素化できます。 ^[3]理想的には、各サンプルを元のpHレベルで試験することが望ましいため、サンプルのpH を変更しないでください。ただし、 pH を調整する必要がある場合は、サンプルに水酸化ナトリウム溶液または塩酸を追加して行う必要があります。 ^[3]

水サンプルとは異なり、土壌や堆積物のサンプルは均質ではありません。^[13]その結果、そのようなマトリックスから代表的なサンプルを得ることは困難です。 毒性物質は粒子状物質に結合する可能性が高く、毒性物質が結合する程度は粒子の組成によって異なります。 たとえば、粘土などの小さな粒子は化学物質にしっかりと結合し、イオン交換樹脂のように機能します。^{[12] [13]堆積物と土壌のマイクロトックス試験は、} Allivibrio fischeriとの接触のためにマトリックスを準備する方法が異なります。 代表的な土壌または堆積物のサンプルを得るには、エルトリエート試験を行う必要があります。 堆積物のエルトリエートは、蒸留水、生理食塩水、または塩化メチレンやヘキサンなどの有機溶媒による抽出によって調製できます。^[12]エルトリエート試験を実行するには、土壌サンプルを抽出剤と一定時間混合し、その後沈殿させて抽出物からサンプルを採取します。採取したサンプルに粒子状物質が含まれている場合は、サンプルを遠心分離して最適な透明度にする必要があるかもしれません。また、堆積物の間隙水は遠心分離によって採取し、抽出せずに検査することができます。^[12]

マイクロトックス試験には、基本試験、100% 試験、固相試験、比較試験、阻害試験の 5 つの主要な試験があります。この 5 つの試験のうち、基本試験、100% 試験、固相試験の 3 つは、堆積物と土壌の試験に使用されます。 ^[12]これらのバージョンはすべて、再構成溶液でAllivibrio fischeri 試薬を再構成するという同じ一般的な方法に従います。塩分と粒子状物質の補正が行われ、その後、特定の試験の方法に応じて、細菌がサンプル溶液にさらされます。細菌をサンプルにさらしてから 5 分後と 15 分後に、光度計を使用して細菌の光出力が測定されます。 ^{[12]測定された光はサンプルの毒性と直接相関しており、} EC50または IC50、またはその他の ECxx 値と ICxx 値の計算を可能にするデータを生成します。^[14]

急性毒性基本試験は、サンプルの相対的な急性毒性を測定する手順です。この試験は、毒性が不明なサンプル、毒性レベルが高いサンプル、または試験結果に最高の信頼性と精度が必要な場合に最適なプロトコルです。この試験は、2つのコントロールと8つのサンプル希釈液の2重試験で構成されています。^[14]

急性毒性100%試験は、サンプルを100%のサンプル濃度で試験する手順であり、その結果、試薬溶液をサンプルに直接添加することが含まれます。^[15]この試験は、毒性レベルが低いと予想されるサンプルに使用され、一般的に環境スクリーニングツールとして使用されます。基本試験と比較して、オペレーターの技術に敏感であり、結果として精度が低くなる可能性があります。^[12]

急性毒性固相試験は、試験生物を水性懸濁液中の粒子として固体サンプルに直接接触させる手順である。通常、この試験では、同じサンプルの溶出液または間隙水試験と比較して、同等またはそれ以上の毒性を示す結果が得られる。^{[16]これは、直接接触によるバイオ}アベイラビリティが同等または増加するためである。この試験は、サンプルの濾過、色による光の吸収、濁度による光の散乱など、毒性以外の影響による細菌の損失を含む、発光の干渉源がいくつかある。^[16]毒性がないことがわかっている同様の粒子組成のサンプルを試験することで、修正を行うことができる。この試験は、2 つのコントロールと 13 のサンプル希釈液の 2 重試験で構成される。^[16]固相試験では、間隙水と溶出液では必ずしも可能ではない方法で細菌を曝露する。^[12]

急性毒性比較試験および阻害試験は、基本試験を使用して ECxx を決定できない場合に、毒性レベルが低いサンプルを試験するための最良の手順です。^{[17]これらのプロトコルは、}廃水処理場の排水、雨水流出、飲料水、間隙水、および溶出液の試験に推奨されます。 ^[17]これらの試験では、単一濃度のサンプルを複数回反復します。基本試験と同様に、比較試験プロトコルでは、時間指定の光レベルの読み取りを補正するために使用されるゼロ時間の光の読み取りを使用します。阻害試験手順では、ゼロ時間の光の読み取りを使用しないため、時間指定の光レベルの読み取りに補正係数を使用できません。これらの試験は両方とも、5 つのコントロールと単一濃度のサンプルの 5 つの反復で構成されています。^[17]

Microtox OmniソフトウェアはAzur Environmentalによって開発され、Microtox Model 500 Analyzerのユーザーがテストを実行し、データを視覚化し、統計を計算し、レポートを生成できるようにします。^[18]このプログラムには、一般的に使用されるすべての毒性テストのテンプレートのセットが含まれており、提供されているテンプレートを変更または追加できます。これらのテンプレートを変更することで、ソフトウェアに元々含まれていない新しいテスト形式を作成できます。^[18]このソフトウェアに含まれるテストテンプレートは、特定のテスト方法のすべてのパラメーターを定義します。このプログラムは、Model 500 Analyzerで目的のテストを設定する最も効率的な方法を計算します。Microsoft Omniには、目的のテストを設定して実行する方法についてのリストされた手順を提供するテストチューターも含まれています。^[18]このソフトウェアを使用すると、ユーザーはMicrotox DOSソフトウェアの以前のバージョンからファイルを読み込むことができ、新しいデータを元の形式で保存することもできます。このソフトウェアにはデータベースが含まれており、ユーザーは他の多くのユーザーやテストサイトのデータにアクセスして、時間の経過に伴うデータや傾向の変化を比較することができます。Microtox Omniは任意の数のデータベースで使用できます。^[18]

Microtox は、環境および産業分野でさまざまな用途に使用されています。一般的な用途としては、海水と淡水の両方の毒性、および堆積物中の農薬やその他の無機および有機化学物質の検査が挙げられます。^{[引用が必要]}

飲料水：マイクロトックスは、偶発的または意図的な汚染の可能性がある多くの地域で飲料水源を検査するために使用されています。飲料水中の有毒汚染物質は、光の色や強度の変化、または酸素使用率の変化によって示されます。^[8]

湖と川：マイクロトックスは、金属や非特異的汚染物質で汚染された湖や川の堆積物の毒性を試験するために使用されます。堆積物には固相試験が使用され、間隙水には基本試験または100％試験が使用されます。^[12]

堆積物試験：マイクロトックスは、金属や有機物で汚染されたさまざまな海洋および淡水堆積物の毒性を試験および評価するために使用されます。汚染された土壌、掘削泥、およびスラッジの水抽出物。マイクロトックスデータは、明らかな影響閾値（AET）や堆積物の品質基準を確立するために使用され、NPDES許可やスーパーファンド浄化レベルにも使用されます。^[12]

産業用：このバイオアッセイは、複雑な産業排水源の毒性評価に使用されます。これは、大量のサンプルを監視およびテストするための費用対効果の高い方法です。マイクロトックスは早期警告システム（EWS）としても適用でき、有毒物質の存在を検出するのに役立つだけでなく、他のバイオアッセイやテストの結果を予測することもできます。^[19]

Microtox は、 in vitro の代替として動物実験にも応用されています。^{[引用が必要]}

マイクロトックスの結果と魚類、甲殻類、藻類の毒性値を比較した多数の研究と公開データでは、正の相関関係が見つかっています。^[20] しかし、光度が生物の生存に与える影響は不明であると指摘する人もいます。また、堆積物自体ではなく堆積物抽出物の使用に関する懸念も表明されています。水溶性汚染物質のみが検査される可能性があり、そのため堆積物に存在する汚染物質の全範囲を代表していない可能性があります。抽出物は、生物学的に利用可能でない汚染物質も除去する可能性があります。これにより、汚染物質とその生物学的影響が過大評価または過小評価される可能性があります。^[12]